动物造模,打击模型 中国实验动物信息网 2022-02-02 3892

　　一、实验目的

　　随着交通及建筑业的发展、意外事故及自然灾害的出现，创伤性脑损伤(TBI)的发生率逐渐增加，创伤性脑损伤在全球意外伤害的死亡和伤残原因中居首位，带来了诸多经济、医疗等社会问题。创伤后出现的继发性脑损伤是导致颅脑损伤患者死亡和病残的重要原因。认识脑损伤的机制及损伤后行为学变化，在此基础上制定合理有效的治疗及康复措施成为临床工作者的目标。本实验参照Feeney自由落体模型设计并适当改进打击装置，以一定程度打击力制作小鼠创伤性脑损伤模型，探讨该模型的制作方法与损伤后的行为学变化，以及在脑外伤研究中的实用价值。

　　二、实验原理

　　通过调节撞击锤的质量和下落的高度来复制不同程度的创伤性脑损伤模型。在轻度损伤的情况下，这个模型类似于创伤性颅脑损伤的脑震荡但不出现明显的挫伤或局灶性损害。如果进行更大力度的打击，这个模型就可以制造类似于临床见到的脑挫伤的局灶性损伤。

　　三、实验材料与方法

　　(一)实验材料

　　1.脑损伤模型装置  该模型装置由底座、撞击杆、下落击锤、砝码和外周导管组成。撞击杆头端直径4.5mm，高2.5mm。外周导管高40cm(有刻度线)，每隔1cm有一气孔，以防止击锤下落时导管内空气压缩阻力的影响。铁制砝码为20g，直径15mm。通过调节撞击锤下落的高度来复制不同程度的创伤性脑外伤模型。

　　2.实验动物与分组  动物选择及分组：取雄性、健康、月龄(7个月)、体重相似的小鼠[(25±5)g]20只，随机分为两组：TBI组10只，假手术组10只。动物自由饮食，室温22～25℃。

　　(二)实验方法

　　1.脑外伤模型制作方法  将小鼠提前3d单独喂养。术前禁食8h。实验时用3.6％水合氯醛以1ml/100g体重的剂量腹腔内注射麻醉，俯卧位固定于木板上；常规消毒皮肤，正中剪开，剥离骨膜，暴露右顶骨；用牙科钻在冠状缝后1.5mm，中线后2.5mm处钻一直径为5mm的骨窗，保持硬膜完整；将撞杆置于硬膜上，用20g砝码分别于10cm、20cm、30cm高度坠落，撞击撞杆从而撞击硬膜，3种致伤冲击力大小分别为100g·cm、200g·cm、300g·cm，分别致右顶叶轻、中、重度脑损伤；打击后切口内滴注4万U硫酸庆大霉素4～5滴，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。于恒温烤箱旁护理。假手术组仅开颅窗后用骨蜡封闭，不施加打击。单独饲养，注意保温。

　　术后护理：术后将动物分笼饲养，自然光照、通风；并勤换清洁、干燥的饲养笼垫料，始终保持干燥；加强营养，喂食鸡蛋、葵花籽，将饲料、饮水置于动物可及范围；严密观察动物精神状态、饮食、排尿排便、有无肢体水肿和压伤、有无泌尿系统血性分泌物等情况；腹腔注射青霉素每次10万u，每日2次；预防自残、肠梗阻。

　　2.神经功能损伤严重程度评分  神经功能损伤严重程度评分是目前较常用的测试脑外伤后运动功能的神经行为学评价方法，由10项不同的任务组成，用于评价伤后小鼠的运动能力、平衡能力、机敏程度等。作者参照Beni-Adani等(2001年)的评分方法进行了一些调整，脑外伤造模前训练小鼠，训练持续1个月，使每只小鼠的评分达到10分。成功造模后，不同测评人员采用盲评法于第0天、第1天、第4天、第7天、第10天、第15天、第19天、第24天和第28天进行损伤后神经功能损伤严重程度评分。*高分为10分，*低分为0分。评分结果：9～10分表示极重度神经功能损伤：7～8分表示重度神经功能损伤；5～6分表示中度神经功能损伤；小于5分表示轻度神经功能损伤。具体评分指标见表3-1。

　　(三)统计学分析

　　应用SPSS17.0统计软件包，计量资料结果均采用均数±标准差(x-±s)表示，对所测量结果进行正态性及方差齐性检验。组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　四、实验结果

　　(一)小鼠创伤性脑损伤模型建立结果

　　小鼠在术后2～3h均完全清醒，TBI组所有小鼠均表现为丧失损伤侧后肢运动能力，单侧(损伤侧)偏瘫，损伤平面以下肌张力降低，损伤侧后肢对针刺无反应，且不能直线行走。表明，TBI造模成功。

　　(二)创伤性脑损伤后小鼠神经功能损伤严重程度评分(NSS)结果

　　NSS结果显示：TBI组各时间点评分结果与Sham组相比均存在显著统计学差异(P<0.05)，表明本实验成功建立了小鼠创伤性脑损伤(TBI)模型，且属于中重度神经功能损伤。 TBI实验组小鼠神经功能损伤严重程度评分均随时间的延长逐渐降低(表10-2和图10-1)，并且第10天后，TBI小鼠的NSS开始小于5分，属于轻度神经功能损伤。提示TBI术后随着时间的推移，小鼠的神经功能在逐渐恢复。并在第28天时，运动能力及平衡能力明显改善。恢复到接近正常水平。

　　五、结果分析

　　本实验在Feeney等创造的以固定高度自由落体方法施加打击大鼠的颅脑损伤模型的基础上进行改造，运用重物从一定高度直接落下，撞击动物头部，造成局灶性脑损伤模型。撞击部位位于顶叶支配运动和躯体感觉的“后肢”区域，此区相对较平坦且操作方便。该区受损后可产生损伤对侧肢体的神经功能障碍，如活动受限、行动迟缓等。此模型死亡率低，未发现低位脑干及延髓损伤，可能与作用力方向上的脑干压缩损伤少有关。本实验所用模型在颅骨开骨窗后施加撞击，避免了颅骨厚度的差异对实验结果的影响。可明确进行损伤程度的分级，且相同程度损伤组内各动物损伤程度和范围基本一致。TBI造模小鼠在术后2～3h均完全清醒，并且均表现为丧失损伤侧后肢运动能力，单侧(损伤侧)偏瘫，损伤平面以下肌张力降低，损伤侧后肢对针刺无反应，不能直线行走；并且TBI组各时间点评分与Sham组相比均存在显著差异(P<0.05)，表明本实验成功建立了小鼠创伤性脑损伤(TBI)模型。本模型操作简单，可控性好。能定量且基本符合临床创伤性脑损伤的病理学改变与病理生理特点。

　　六、经验与体会

　　实验过程中为了尽量减少误差，保证实验结果的准确性，在制作模型时应把握以下几点：①麻醉时要严格控制麻醉剂量，如麻醉过深，则损伤小鼠容易产生呼吸抑制而死亡，麻醉过浅则影响实验操作及可控性。②开骨窗时，将右侧颞肌稍向外分离，否则面积太小。不易扩大骨窗。以选择前囟后约1.5mm为佳。太靠内侧易损伤上矢状窦，导致大出血，手术失败；太靠外侧则受力面不平，易导致脑损伤受力不均，损伤程度大小不一，且易引起脑膨出。③制作一定程度损伤模型时，注意保持多次重复实验的打击高度及角度的一致性。以保证每次的打击位置及力度一致。④注意术后护理、保温、营养等。