动物实验 中国实验动物信息网 2020-08-25 712

　　摘要   接种疫苗是预防传染病和免疫相关疾病的有效策略，在人类历史上取得了显著的贡献。*近越来越多的关注移到黏膜疫苗，由于其比传统的方法有多个优点。黏膜疫苗亚基或肽抗原免疫比活或减毒的病原体更合理，但免疫应答需要增加佐剂。针对不同的病因，许多的黏膜佐剂已发展到*好的免疫反应。同病原菌来源的佐剂相比，天然内源性分子纳入黏膜疫苗表现出突出佐剂效果和安全性。目前，细胞因子是*为广泛的应用于黏膜佐剂参与免疫反应信号转导、激活固有免疫和极化适应性免疫。对细胞因子与相应的受体之间的特异性相互作用的基础上，理想的免疫反应是迅速和有效的。此外，其他一些天然的分子也被确定为有效的黏膜佐剂。本文综述了天然内源性佐剂，以阐明黏膜疫苗的发展。

　　关键词   黏膜疫苗 佐剂 与生俱来的内源性分子

　　简介：黏膜接种是防止感染的直接策略，在进入机体前，病原体启动感染通过宿主黏膜。与其他接种疫苗的方法相比，黏膜疫苗接种是可取的，因为许多原因。首先针对预防接种，受接种者和社区提供安全的免费疫苗，尤其是在发展中国家。冷链自由配送降低了疫苗的运输和储存成本。黏膜免疫的易操作性，有助于摆脱对接种人员的依赖，这是疫苗接种的灵活性。此外，黏膜免疫增加推荐疫苗接种计划建议的依从性和减少疫苗接种的副作用，尤其是儿童。黏膜疫苗*明显的优势是，在黏膜部位的快速传递有效诱导黏膜免疫应答，特别是黏膜IgA的分泌。黏膜IgA是监察者或中和黏膜病原体和激活入口补体途径。此外，黏膜疫苗还诱导全身性免疫反应，包括血清抗体的产生和远端部位的细胞介导的反应。

　　黏膜表面有丰富的免疫器官，因此，理论上所有的黏膜部位能够被用作接种疫苗的途径。从逻辑和实际考虑，黏膜疫苗的位点都集中在口服和鼻。虽然口服疫苗已成功地用于对抗小儿麻痹症，霍乱和伤寒，鼻腔给药是*有效的方式，在多个黏膜部位诱导有效的和广泛的黏膜免疫反应。此外，大量的免疫原诱导口服耐受，口服给药容易容易被胃酸消化，抑制口服疫苗的使用。鼻黏膜的面积小需要少量的抗原，而鼻环境中缺失酸性环境则保持了抗原的稳定性。

　　活疫苗或减毒活疫苗对控制传染病是有效的。但是活疫苗或减毒疫苗的安全问题一直有争议，阻碍了其临床应用过程。这是可能的，接种疫苗的病原体可能恢复到野生型或在宿主体内复制成高毒性的生物。因此，纯化的保护性抗原是更受重视的新一代的黏膜疫苗。可溶性抗原的直接黏膜免疫只引起相对低的免疫原性。因此安全有效的黏膜佐剂同抗原常联合用药，提高非活疫苗抗原的免疫原性。此外，佐剂被定义为免疫增强剂不同于先前的输送系统。

　　病原菌来源的佐剂或衍生物被广泛用于黏膜疫苗的佐剂系统。虽然有些佐剂有潜在和广泛的免疫反应，非人类产品的毒性威胁和副作用应仔细评估。例如，一个鼻肠毒素佐剂流行性感冒灭活疫苗上市一段时间后撤回，由于该佐剂的使用可能导致面瘫。显然，由于先天物质毒性较小，与生俱来的分子作为佐剂比其他成分更有利。防止感染的先天内源性佐剂的性质对黏膜疫苗的发展将在下面部分广泛地讨论。

　　细胞因子：细胞因子是散在的，归类于信号蛋白，这是由广泛的细胞释放的。

　　细胞因子网络激活和调节先天免疫和适应性免疫的发展，平衡体液免疫和细胞介导的免疫反应。因此，在宿主防御和调制免疫相关疾病他们是重要的。免疫反应可以通过简单地增加这些信号分子如蛋白质或DNA片段被启动。强调潜在的疫苗佐剂。免疫系统中的一些细胞因子进行了很好地研究和探讨，以提高疫苗的疗效。

　　I型干扰素：I型干扰素（IFNs）一直被认为是抗病毒药物和启动免疫反应发展。一些临床报告清楚地显示，人类干扰素α的黏膜传递对癌症、自身免疫性疾病和呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、乳头瘤病毒、艾滋病毒和肝炎病毒引起的流感病毒感染有直接预防和治疗的效果。1型干扰素黏膜给药后基因编码的趋化因子，细胞因子和蛋白酶的表达明显上调。与抗原处理和淋巴细胞活化、迁移、凋亡和蛋白降解密切相关。

　　IFNα/β治疗增加小鼠鼻粘液层抗原呈递细胞APCs对抗原的摄取。IFN-α低剂量黏膜给药有效的激活自然杀伤细胞，外周循环中的B细胞和T细胞亚群的增殖。I型干扰素在某些很好研究过的佐剂中发挥信号作用，包括Th1细胞和CTL极化类型。另一方面，I型干扰素，免疫抑制剂在黏膜中的应用有效诱导抑制性T细胞，减少了细胞毒性T细胞及相关细胞因子产品，当遇到自身免疫性和炎症性疾病时。口腔黏膜给药的小鼠IFN-γ显著降低特异性过敏原IgE的产生和小鼠无毒性检测嗜酸性粒细胞的产生。

　　IFN-α/β与流行性感冒病毒亚单位疫苗鼻内免疫能引起一个有效的体液免疫反应，防止小鼠流感病毒感染和体重下降。小鼠Ⅰ型干扰素和流感病毒A免疫小鼠能产生高水平的血清和黏膜抗体，有效的清除在肺的病毒。然而人体试验表明，无论是血清血凝抑制和中和抗体反应小鼠I型干扰素IFN存在显著升高。小鼠干扰素IFN-β和流行性感冒灭活疫苗鼻腔给药显着减少的致死剂量流感病毒对小鼠死亡是一个挑战。小鼠I型干扰素同用致死剂量的脑心肌炎病毒、水泡性口炎病毒或水痘带状疱疹病毒的配合口服给药能显著升高小鼠的生存率。

　　痘病毒同干扰素ε滴鼻免疫升高肺特异性CD8+ CD107a +干扰素-γ+的表达。增强淋巴细胞肺泡滤过性减轻炎症，提高在小鼠肺淋巴结功能性/细胞毒性CD8 + CD4 + T细胞亚群(CD3hiCCR7hiCD62Llo)的功能，增强肺快速清除。

　　I型干扰素的刺激免疫效果严重依赖于时间和黏膜给药的剂量。例如，给予免疫干扰素抑制免疫球蛋白的生产和B细胞的转换。此外，高剂量的I型干扰素有免疫抑制作用。同时，I型干扰素在自身免疫性疾病和炎症的情况下被认为是免疫抑制剂。一些报告显示，I型干扰素的使用对有害病原体的清除是有害的。从而说明I型干扰素的作为免疫调节剂或免疫抑制剂的神秘角色需要进一步研究。但不限，运输地点，调节机制，*佳剂量和I型干扰素的使用时间，以及疾病和环境情况。

　　IFN-γ   FN-γ，主要由T细胞和NK细胞产生，对抗原或有丝分裂原反应。在T细胞活化和建立的适应性免疫起着关键作用，小鼠干扰素-γ和流行性感冒灭活疫苗鼻腔给药致死剂量对小鼠生存率产生了挑战。进一步的分析表明，在感染的早期阶IFNγ综合组增强IgA和IgG抗体滴度。同一组的HI抗体滴度显著低于只给疫苗的感染晚期的小鼠。小鼠口服致死剂量的脑心肌炎病毒和干扰素IFNγ能显著升高小鼠的生存率。全身和黏膜抗原特异性IgG1和IgA抗体是由聚乳酸微囊V鼠疫菌抗原和IFN-γ鼻内共注射来增强的。然而，在小鼠模型中防止全身性细菌感染，这一提法是有害的。低剂量的小鼠IFN-γγ通过饮用水提供给成年HAM/ ICR小鼠，下面是一天后鼠伤寒沙门氏菌的挑战，与对照组小鼠相比，干扰素IFNγ的应用显著延长小鼠存活时间，减少沙门氏菌入侵肠上皮细胞、沙门氏菌增长和繁殖。报告中观察到不良反应。像I型干扰素，使用剂量和IFN-γ黏膜治疗免疫计划γ应该被优化。

　　GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）提高抗原呈递细胞（APCs）的招聘和活化。人GM-CSF鼻腔给药增强兔血清GM-CSF水平和增加总白细胞计数。肺抗原呈递细胞（APCs）及细胞因子的水平，包括IFN-γ和IL-12p40，显著升高，均给予呼吸道合胞病毒RSV表达重组小鼠GM-CSF鼻内给药后。此外，GM -CSF编码病毒病毒特异性Th2转移向Th1型。HIV DNA疫苗同小鼠质粒表达的GM-CSF共同使用鼻内注射，诱导高水平的全身和黏膜抗原特异性抗体和增强小鼠迟发型超敏反应。腺病毒载体介导的小鼠GM-CSF和β-淀粉样蛋小鼠鼻内免疫白优势抗原特异性IgG1和IgG2b反应，提示GM-CSF极化Th2免疫反应。表达小鼠GM-CSF重组水泡性口炎病毒在病毒的传播和发病机制方面被高度灭活。进一步的分析表明，遗传GM-CSF增强巨噬细胞的招聘、CD8 T细胞记忆和小鼠免疫回忆反应。

　　与亲本病毒相比，小鼠口服免疫重组狂犬病毒表达GM-CSF具有增加DCS数量和在外周免疫B细胞、更高水平的适应性免疫应答和增加病毒的抵抗力。鼻内给药GM-CSF表达减活HSV诱导保护性免疫反应对病毒减少小鼠使用的致死剂量。小鼠GM-CSF表达卡介苗经鼻给药显著升高肺DC的数量和免疫调节细胞因子IL-12的分泌。相应地，在纵隔淋巴结和肺增加抗原特异性CD4 + T细胞。更重要的是，与仅使用 BCG免疫小鼠相比， BCG：GM-CSF的使用能显著降低感染结核分枝杆菌的剂量。在上述证据的基础上，GM-CSF共同给药有利于APCs对抗原招聘，从而启动免疫应答。

　　肿瘤坏死因子（TNF）家族：肿瘤坏死因子（TNF）/肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族在维持免疫系统稳态的过程中极为关键。在炎症和宿主防御方面，有很好的保护效果。肿瘤坏死因子-α伴随抗原共同鼻内使用在小鼠体内诱导产生抗原特异性IgG和黏膜IgA抗体。通过细胞因子的分析，黏膜应用TNF-α能诱导Th2型免疫反应。在小鼠实验中，证明了TNF-α的佐剂作用是有效和安全的，TNF-α的免疫佐剂至少部分与上皮通透性增加是相关的。HIV突变株与TNF-α免疫佐剂作为黏膜疫苗诱导抗原特异性IgG。当通过小鼠鼻腔给药时，引起局部或远处黏膜IgA抗体反应。TNF家族的其他成员也在小鼠进行了黏膜佐剂测试。抗原同TL1A或APRIL鼻腔给药诱导较强的抗原特异性黏膜免疫和体液免疫。有趣的是，肿瘤坏死因子与CTB诱导的免疫反应大小相当，说明这些佐剂候选都有希望取代毒素类佐剂。

　　IL-1：各类细胞分泌的IL-1是一种具有广泛的宿主免疫系统影响的促炎细胞因子，包括上调和下调许多与其他细胞因子相关的趋化因子、粘连、细胞分化和迁移的基因。可溶性抗原结合人类IL-1α或IL-1β小鼠滴鼻免疫产生体液免疫和细胞免疫。同抗原和CT佐剂引起的反应效果相当。抗原和IL-1α或IL-1β共同使用后，抗原特异性血清IgG，阴道IgG和IgA，全身延迟型高敏和淋巴细胞增殖反应明显升高。IL-1小鼠鼻腔给药α诱导有效全身和黏膜免疫反应，依赖于基质细胞IL-1R1的表达。此外， IL-1α诱导适应性免疫是依赖CD11c+细胞。在小鼠鼻腔免疫后，在诱导HIV特异性血清IgG方面，IL-1α表现出显著的佐剂活性。此外，小鼠IL-1α和HIV抗原鼻腔免疫后，诱导明显的CTL反应和抗原特异性IFN-γ分泌细胞。此外，人类IL-1α鼻腔给药被证明在灵长类动物模型中是安全和有耐受性。链球菌蛋白抗原和人类IL-1引起扁桃体应用比单独使用抗原更高水平的黏膜IgA和血清IgG抗体。链球菌的迟发型超敏反应、通过耳肿胀和IFN-γ水平增加确认，只有在IL-1免疫的家兔上能发现。与流感病毒血凝素（HA）与小鼠IL-1α/β鼻腔给药引起Th1和Th2型细胞因子的增加和全身IgG和黏膜IgA抗体。此外，小鼠IL-1α/β和HA共同给药免受流感病毒的致死性感染。对小鼠肺炎链球菌致死剂量后，人类IL-1β佐剂鼻腔给药是有效的如同明矾佐剂皮下免疫效应，产生同效的抗体水平和保护。像皮下免疫ISA-51（油包水乳化佐剂）和鼻CTX佐剂一样，IL-1β是一个有效的鼻疫苗佐剂诱导机体产生保护性免疫对抗全身性破伤风毒素。尽管IL-1佐剂活性非常有效，IL-1的多效性的特点容易引起不良免疫反应，需要对IL-1的黏膜佐剂有明确的优化程序。

　　IL-2：IL-2主要由T细胞遇到抗原后产生，免疫应答过程中有助于T细胞生长、增殖分化。用活的乳酸乳球菌作为鼻腔给药载体，小鼠IL-2的细菌表达增强抗原（破伤风毒素C片段）的特异性免疫应答。此外，DNA疫苗与质粒表达IL-2诱导Th1免疫应答。鼻内交付质粒编码IL-2转移TT或CT诱导的Th1型反应向Th2型免疫应答转变。小鼠口服质粒表达的免疫球蛋白IL-2/Ig后，抗原特异性IFN-γ、IL-2和IL-4生成增强。此外，IL-2/Ig基因法能引起高CTL活性和高水平黏膜/血清抗体。在一个鸡滴鼻免疫后，灭活禽流感病毒与IL-2共同使用能增强局部免疫反应。

　　IL-4和IL-5：在正反馈循环中，细胞因子IL-4诱导的T细胞从幼稚的Th0细胞分化为Th2细胞，从而产生额外的IL-4。此外，IL-4参与激活B细胞和T细胞的增殖，及B细胞分化为浆细胞。小鼠免疫遗传HIV抗原和小鼠IL-4滴鼻能诱导高水平的全身和黏膜抗原特异性抗体。此外，IL-4表达质粒主要诱导血清IgG1亚型，但是明显抑制迟发型超敏反应和CTL反应。聚左旋乳酸微囊V鼠疫菌抗原和IL-4滴鼻免疫诱导的全身和黏膜抗原特异性IgG和IgA。然而这种结合疫苗可以降低细菌注射后小鼠的存活率。

　　IL-5由Th2细胞产生，肥大细胞刺激B细胞生长，增加免疫球蛋白的分泌，介导嗜酸性粒细胞活化。小鼠鼻内接种小鼠IL-5表达的腺病毒增加肺灌洗液中病毒特异性IgA抗体滴度。

　　IL-6：IL-6是一种多效性细胞因子，调节T细胞和B细胞。腺病毒介导小鼠IL-6鼻内接种增加小鼠肺灌洗液的病毒特异性IgA/G滴度。在肺淋巴细胞IL-6表达腺病毒免疫小鼠，病毒特异性抗体分泌细胞出现频率高。组织学分析表明pIL-6接种部位积累了大量的单核细胞。

　　IL-12由树突状细胞、巨噬细胞和人B淋巴母细胞自然产生，通常诱导Th1反应，刺激NK细胞、T细胞和B细胞产生IFN-γ和TNF-α。通过鼻腔免疫IL - 12的小鼠，IFN-γ和IL-10的mRNA转录持续升高。小鼠鼻内共同使用HIV基因抗原和质粒表达IL-12诱导Th1和Th2型反应。此外，小鼠免疫IL-12和HIV抗原后，高水平的HIV特异性CTL和迟发型超敏反应增强。IL-12鼻腔给药后，血清卵白蛋白特异性抗体水平IgG2a 、IgG2b和IgG3显著升高，而血清IgG1受抑制。小鼠滴鼻免疫TT和CT 同IL-12联合疫苗增加TT特异性CD4 + T细胞分泌IFN-γ和和降低Th2型细胞因子的分泌水平。这意味着CT诱导的免疫反应向Th1型转变。

　　IL-15 IL-15，主要由单核巨噬细胞分泌，诱导先天免疫和适应性免疫系统，如自然杀伤细胞和T细胞的增殖。

　　IL-18 IL-18诱导Th1细胞、NK和CTL细胞的活化， IFN-γ的生成、调节炎性细胞因子的合成，包括IL-2和IL-12. 小鼠IL-18和HIV抗原滴鼻免疫后诱导的显著的CTL反应和抗原特异性IFN-γ分泌细胞。

　　FLT3L   FMS相关酪氨酸激酶-3配体（Flt3L）刺激不同血液细胞祖细胞的增殖和分化，包括T细胞、B细胞、NK细胞和DCs。OVA特异性黏膜和血浆免疫反应均经鼻腔给予OVA后诱导。质粒编码的小鼠Flt3L同OVA单独比较，倾向于Th2型免疫反应。