动物实验,脓毒性脑病 中国实验动物信息网 2020-08-25 844

　　败血症性脑病（败血症相关性脑病，SAE）表现为长期的自主神经功能紊乱，ir妄和认知功能障碍，但确切的机制尚不清楚，尚无有效的治疗方法。研究表明，线粒体功能障碍在败血症多器官衰竭的发生发展中起着重要作用，据推测线粒体功能障碍是SAE的病理生理机制之一。线粒体抗氧化剂肽SS31可以清除线粒体活性氧（ROS），并通过明显的线粒体保护提高5'三磷酸腺苷（ATP）的水平。该研究观察了SS31对SAE小鼠认知和线粒体功能的影响，并为SAE的预防和治疗提供参考材料。材料和方法动物选择和分组由南京军区南京总医院提供，体重20-28 g，每年形成60-60只雄性C57BL/6小鼠。随机分为4组：假手术+生理盐水组（SN组，n10），假手术+ SS-31组（ss组，Zhouyilo），CLP +生理盐水组（CN组，n20）和CLP + SS31组（CS组，n20）。

　　CN和CS组使用盲肠结扎穿孔（CLP）建立SAE模型，而SN和SS组仅进行剖腹手术，盲肠远端分离和腹部闭合。手术后，连续6天腹腔注射5 mg/kg的SS-（31（SS和CS组，上海强药生物技术有限公司）和等体积盐水（SN和CN组）。在手术前建立并禁食12小时，腹膜内注射戊巴比妥钠（40 mg/kg，西格玛）进行麻醉，在腹部中线和肠之间切开1 cm的切口1.2盲肠近端根的CI11为4-0，用丝线进行环形结扎，结扎末端用22号针刺两次，以挤出小便和安置零件并依序缝合腹膜和皮肤，并在8分钟内完成所有操作。行为测试根据文献，对术后7天存活的小鼠进行条件性恐惧实验。将小鼠放在用75％酒精擦拭的实验盒中180秒，然后进行60 S的声音刺激（80 dB，3600 Hz），然后对脚进行电刺激（0.75 mA，1秒），鼠标适应180 S.训练后2和24小时进行了现场和声学实验，现场实验主要反映了海马依赖性记忆，而声学实验则主要针对海马。反映独立的内存V，E8I。在一个场景实验中，将鼠标放在同一环上390S，并在第二个180S中记录冻结时间；在声学实验中，将鼠标放置在不同的环境中。

　　在实验过程中，在没有电击的情况下施加了相同的声音刺激180秒，并记录了其持续时间，在实验过程中，使用SuperFCS系统（上海新阮公司）自动确定了鼠标在电击箱中的活动状态。在每次实验后，用75％的酒精擦洗基体，以免干扰气味。在进行ROS和ATP水平检测行为测试后，每组5只小鼠被处死并新鲜。各种海马组织匀浆技术有限公司的ROS试剂盒（海杰美制药科技有限公司）和ATP试剂盒（海比云天生物科技有限公司）检测ROS和ATP水平说明。配合物I，II，III，IV的酶活性和线粒体膜电位（线粒体膜电位，MMP）检测行为测试通过从每组中杀死5只小鼠获得新鲜的海马组织。请参考线粒体提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。该公司的指示是提取和纯化线粒体。按照线粒体呼吸链复合物活性检测试剂盒和纯化的线粒体膜电位荧光测定试剂盒（上海黎明明基因医学技术有限公司）的说明操作复合物Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的酶活性和MMP水平。

　　SPSS17用于统计分析。 o统计分析软件。测得的数据表示为平均值±标准偏差（i±s），组之间的比较使用方差的单向分析，而成对比较使用SNK方法。

　　结果

　　条件恐惧实验在这项研究中，CN和CS组分别有9例和6例死亡，差异无统计学意义。 SN和SS组没有死亡，但是小鼠还活着完成了条件恐惧实验。与CN组相比，SN，SS和CS组24小时场景实验的冻结时间显着增加（P\u003c0.05）。在两组2小时场景实验，声学实验和24小时声学实验之间，在统计学上没有显着差异。与

　　CN组，SN，SS，CS组相比，ROS，ATP，MMP水平的变化显着降低（P\u003c0.05），ATP和MMP水平显着升高（P\u003c0.05） ），与CS组相比，SN和SS组的ROS水平显着降低，而ATP和MMP水平显着升高（P \u003cⅡ，Ⅲ，Ⅳ酶活性）。与CN组，SN，SS和CS组化合物相比，Physics和III活性显着提高（P\u003c0.05）。与CS组相比，SN和SS组的复合物I和III活性显着增加（P\u003c0.05）。

　　结论

　　在这项研究中，CLP小鼠在手术后第8天显示24小时场景僵硬度显着降低，表现为海马依赖性认知障碍，并随着海马ROS水平的升高而增加ATP。观察到该水平降低。败血症中线粒体和SAE认知功能障碍的病因是由线粒体电子运输链功能受损引起的ROS水平升高和ATP水平降低，以及线粒体复合体，III酶活性和MMP水平降低。猜猜其中之一。在败血症中，对不同组织的线粒体电子传输链的损伤是不同的。 Comim和他的同事在24、48和96小时显着降低了CLP大鼠小脑，海马，纹状体和大脑皮层的线粒体复合酶活性，并显着改变了复合物II，III和IV的酶活性。尽管不是，但是观察到24小时后Davira CLP大鼠脑复合物IV的活性明显降低。此外，佩鲁奇等。我们观察到E113降低了CLP大鼠骨骼肌组织中复合物II和III在12小时的酶活性，并降低了所有复合物在48小时的酶活性。 Zapelini等人观察到3至48小时后，肝脏组织中复合物IV的活性下降。在这项研究中，我们观察到CLP小鼠海马中复合物II和IV的酶活性在第8天显着降低，复合物II和IV的酶活性没有明显变化。此更改可能与CLP时序有关。组织是不同的。线粒体电子传输链复合物和MMP的酶活性是线粒体功能的重要参数。其中，复合物和III是细胞内ROS产生的主要位点。其活性降低可导致ROS显着增加。 MMP是ATP形成的先决条件。在电子传输过程中，质子通过贯通复合物和反向浓度梯度进入线粒体膜，形成线性MMP，并通过ATP合酶的浓度梯度进入线粒体，产生ATP。因此，复合物和III酶的活性降低导致MMP降低，因此ATP产生降低。

　　因此，在这项研究中，CLP引起小鼠海马线粒体功能障碍，主要表现为线粒体复合物和III酶活性和MMP含量下降，同时伴随着ROS水平升高和ATP水平降低。线粒体抗氧化剂肽SS-31可以自由穿过血脑屏障和细胞膜。内线粒体膜浓度比外线粒体浓度高1000倍，并且与线粒体膜电位无关。 SS31可以去除各种细胞内ROS，例如过氧化氢（H.O.），超氧阴离子（OF）和羟基（ΦOH）。它具有增加ATP产量和稳定线粒体膜电位的功能。它在退行性疾病，代谢性疾病和缺血再灌注损伤中起重要的保护作用。在这项研究中，向SAE小鼠模型连续施用SS-31可提高24小时场景实验的刚性，改善小鼠的认知功能，降低海马ROS水平以及ATP和MMP水平。被发现上升，并且复杂的工作被抑制了。 III酶活性的降低明显保护了线粒体。总而言之，线粒体功能障碍可能是SAE认知功能障碍的病理生理机制之一。持续给予线粒体抗氧化肽SS31可以改善败血性脑病小鼠的认知功能，其作用可能与保护线粒体功能有关。