牙髓干细胞 中国实验动物信息网 2020-10-15 401

　　1.对于实验方法，请选择4至6个月大的实验小型猪。在麻醉下，去除迷你猪肉乳的切牙，并在无菌条件下切开脊髓。将牙髓组织切成约1 mm3的小块，并用酶消化。在高糖DMEM培养基中培养。 （1）单克隆细胞的选择：收集第三代细胞，以每毫升50至100个细胞的细胞密度接种到24孔板中，培养10天，并选择具有50个以上细胞的克隆。我会。使用滤纸方法转移至新的24孔板中，融合后将细胞转移至6孔板中，并将培养物扩展至2 x 105、 （2）免疫荧光染色的鉴定：取15个单克隆细胞并接种到24孔板中，每孔2×104个细胞，高糖DMEM培养基，5％CO 2、37℃。加4％，持续24小时。用0.5 ml多聚甲醛固定，在室温下向每个孔中添加0.3％Triton 100 0.5 ml，在室温下放置5分钟，然后在室温下添加10％封闭正常山羊血清和0.5 ml，保持60分钟。丢弃封闭液，并向每个孔中添加1：200小鼠抗体。 0.2 ml人类Nestin抗体，1：600小鼠抗人类β-微管蛋白Ⅲ抗体，1：500小鼠抗Butavimentin抗体，1：200小鼠抗人类STRO-1抗体，在4°C下过夜。吸出一抗，将其丢弃，并用PBS冲洗3次。向每个孔中加入0.2 ml二抗，在37°C下孵育30分钟，然后用荧光显微镜观察并拍照。 （3）诱导分化实验分组：选择对STRO-1表达阳性的单克隆细胞，诱导组A：单克隆起源细胞组；诱导B组：混合细胞起源组；对照组A：单克隆起源细胞组；对照组B：混合细胞源组。

　　2、培养结果（1）小型猪乳牙牙肉细胞的形态特征：用倒置显微镜观察时，细胞形态多样，纺锤体细胞和多边形细胞呈片状生长，细胞体饱满且呈胞质。是统一的，核心是圆形的。核心很明确。神经样细胞像草一样放射状生长，具有小的细胞体和透明的细胞质。随着细胞的通过，神经样细胞主要以纺锤状细胞或多边形细胞的形式消失。

　　（2）单克隆小型猪乳牙的形态特征和免疫荧光染色鉴定结果：小型猪乳牙低密度接种，克隆菌落形成率为2.74％，克隆菌落细胞具有多边形免疫力荧光染色的15个单克隆细胞中有6个表达了血管周表面标志物和骨髓基质前体细胞标志物STRO-1阳性，证实阳性率约为76.4％。在显微镜下，观察到强阳性表达STRO-1的细胞是多边形细胞，并且观察到一些纺锤体细胞表达弱阳性的STRO-1、波形蛋白是间充质来源细胞的典型特征，测试结果表明，所有15个单克隆细胞中波形蛋白均为阳性。全部15个小枝小枝落叶性牙龈细胞均表达神经元细胞特异性抗体Nestin，阳性率约为69.7％。

　　（3）矿化诱导结果：微型猪落叶性牙本质细胞体外培养4周，在矿化溶液诱导下进行Vonkossa染色，全部六个单克隆来源诱导组A ，黑色阳性反应区域较明显且致密，碱性磷酸酶表达清晰，显示红色染色阳性区域。诱导物B和诱导物A之间没有显着差异，对照组A和B分散在矿化点，红色染色区域很小。碱性磷酸酶定量试验的结果是，诱导A组和诱导B组之间，对照组A和对照组B之间的碱性磷酸酶活性存在显着差异，并且诱导A组和诱导B组之间的碱性磷酸酶活性没有显着差异。

　　（4）脂肪诱导结果：诱导IBMX，消炎痛和氢化可的松后，A和B组中的一些细胞被诱导漂浮。可以将三周小型猪乳齿的牙髓干细胞诱导为脂肪细胞。脂肪滴在相衬显微镜下具有清晰的折射率。随着诱导时间的延长，细胞质中的脂质滴逐渐增加，聚集，膨胀并置于葡萄串中。由6种单克隆来源诱导的A组有4个孔，被油红色染色并且在细胞内可以看到橙红色阳性颗粒，脂肪诱导的阳性率很低4倍据计算，在光学显微镜下的20个视野中大约有5个带有脂质滴的细胞出现。 ％。在6种混合来源的诱导B组中，在2孔中几乎没有阳性油红色污渍。对照组细胞无橙红色阳性颗粒，油红色染色阴性。

　　（5）神经元细胞诱导的结果：6种单克隆衍生诱导。 A组有两个孔。细胞的形态急剧变化。原始的大而扁平的细胞体收缩，细胞边缘变得不规则，并且有许多小细胞。手指状突起。诱导后两周，细胞发生明显的形态变化，细胞体进一步收缩形成圆形，不规则的圆锥和三角形。一些细胞具有多个突起和分支，并且末端类似于神经细胞。结束。诱导后，免疫荧光染色的结果对β-微管蛋白-III抗体呈阳性，对STRO-1抗体呈阴性。根据细胞形态分析和免疫荧光染色的结果，将落叶的牙髓干细胞分化为神经细胞。在诱导的B组以及对照组A和B中没有明显的神经细胞出现。