碱裂解法提取质粒DNA 中国实验动物信息网 2020-10-14 510

　　碱裂解法提取质粒DNA的步骤

　　（1）选择一个在LB固体培养基中生长的菌落，将其接种在20 ml LB（包括Amp100ug/ml）液体培养基中，并在37°C和250mp（约）下振摇过夜。 12-14小时）。

　　（2）取1.5 ml培养液，倒入1.5 ml Eppendorff管中，以12000pm离心1-2分钟。弃去上清液，将离心管倒置在厕纸上，以使尽可能多的液体排出。

　　（3）将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中（必须剧烈振摇以均匀分散和混合细菌），并在室温下放置5-10分钟。

　　（4）加入200μl新制备的溶液II，合上试管口，将Eppendorff试管快速几次轻轻颠倒以混合内容物（不要摇动），并在冰中沐浴5分钟以达到细胞膜的作用。 （溶液II是一种溶解溶液），因此离心管中的细菌液逐渐变得澄清）。

　　（5）加入150μl预冷溶液III，紧紧盖住管口，轻轻颠倒管数次以混合，并检查是否有白色棉样沉淀物。您可以将其放在冰上5分钟。以12000pm离心10分钟。解决方案III是中和解决方案。此时，质粒DNA再生，染色体和蛋白质形成不可逆的不可溶复合物，而K +沉淀SDS-蛋白质复合物。

　　（6）将上清液转移到干净的Eppendorff管中，加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇，摇匀并在12000pm下离心10分钟。 （450μl苯酚/氯仿/ iso 96 penta）

　　（7）小心地将上清液移至新的微量离心管中，加入两倍量的预冷无水乙醇，充分混合并在室温下放置。在12000pm x 10分钟下离心2-5分钟。

　　（8）弃去上清液，打开试管并放在卫生纸上，以排出所有液体，加入1 ml 70％的乙醇洗涤沉淀并在12000pm下离心5分钟。 ..

　　（9）吸去上清液，将试管倒置并放在厕纸上，沥干液体，使其在室温下干燥。

　　（10）将沉淀物溶于20μlTE缓冲液（pH 8.0，含20μg/ mlnaseA，约4μl）中，并在37°C的水中浸泡30分钟，以在-20°C下降解RNA分子。存放在冰箱中。

　　2.10.2实验试剂和制剂：

　　（1）LB液体介质

　　称取10 g胰蛋白,、 5 g酵母提取物（酵母提取物），10 gaCl，溶于800 ml蒸馏水中，并用NaOH调节pH值。调整7.5、加水直至总体积为1升，并在高压下蒸汽灭菌15分钟。

　　（2）氨苄西林（Ampicillin，Amp）母液：制成100 mg/ml水溶液，并储存在-20°C以便以后使用。 （3）溶液I  50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）。制备方法：将ddH 2 O加入到12.5ml 1MTris-HCl（pH8.0），10ml 0.5MEDTA（pH8.0），4.730g葡萄糖和500ml中。在121°C高压灭菌15分钟，然后在4°C储存。

　　（4）溶液II 0.2MNaOH，1％SDS

　　制备方法：将2MNaOH1ml，10％SDS1ml，ddH2O加入10ml。使用前的临时设置。 （5）溶液III：钾乙酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8

　　制备方法：将ddH2O加入300 ml 5MKAc，57.5 ml冰醋酸和500 ml中。存放在4°C以便以后使用。

　　（6）苯酚/氯泡沫/异戊醇（25：24：1）

　　氯泡沫有助于使蛋白质变性并使液相与有机相分离。异戊醇可以消除泡沫提取过程的发生。苯酚和氯仿均具有高度腐蚀性，在操作过程中需要戴手套。

　　（7）无水乙醇

　　（8）70％乙醇

　　（9）TE：10mMTris-HCl（pH8.0），1mM MEDTA（pH8.0）。制备方法：将ddH2O加入1ml 1M Tris-HCl（pH8.0），0.2ml 0.5MEDTA（pH8.0），100ml中。在121°C下高压灭菌20分钟，并在4°C下保存以备后用。

　　1MTris-HCl（Tris（三羟甲基）氨基甲烷）制备：将121 g Tris碱溶解在800 ml H2O中，用浓盐酸调节pH值，充分混合并加水至1L。

　　0.5MEDTA（乙二胺四乙酸）：将186.1gNa2EDTA.2H2O溶于700mlH2O，用10MNaOH将pH调节至8.0（需要约50ml），然后将H2O加至1L。

　　（10）RNase A母液：将RNase A溶解在10 mmol/LTris？Cl（pH 7.5），15 mmol/LaCl中制成10 mg/ml溶液，并在100°C加热15分钟。冷却后，使用1.5 ml的Eppendorff管将其破碎成小块，并保存在-20°C下。