牙周膜细胞培养 中国实验动物信息网 2020-10-15 402

　　1.实验方法：6个月大的小型猪，重约25公斤，小型猪会定期麻醉。在无菌条件下拔出微型猪上颌和下颌的八颗前牙（4条狗和4个切口），并立即放入装有D-Hank平衡盐溶液的无菌包装瓶中，该盐溶液中含有双重抗体。  轻轻摇动5-10分钟以洗去牙齿根部表面的血迹，然后立即在冰浴下送到实验室。在超干净的工作台中，使用持针器将牙颈的根部表面朝上固定，并使用20 ml无菌注射器抽吸无菌生理盐水以清洁牙根表面。反复冲洗。锋利的龈下刮匙刮去根部的牙周膜的三分之一、将组织切成约1 mm3的小块，每块相距约5 mm，均匀地放置在25 cm2的一次性无菌培养瓶中。接种。下。倒置培养瓶，并向烧瓶和细胞培养箱（5％CO2、37°C）中注入3 ml高糖DMEM培养液，其中含有200 ml/L牛胎儿血清，100 U/ml青霉素，100 g/L链霉素。孵育（100％湿度）。附着小组织碎片2-4小时后，将培养瓶缓慢翻转并放平，以便液体缓慢覆盖小组织碎片并开始培养。接种后一周内，组织块未牢固附着，应避免液体交换和观察，以防止组织块受到撞击和漂浮。之后，每三天更换一次培养液，每次加入3-4ml培养液，仔细观察细胞生长，并游泳。

　　2、实验结果

　　（1）小型猪牙周膜细胞培养的成功率：在抽取的4只小型猪和4只狗中，通过组织块培养法得到的4个切牙的牙周膜正常。被耕种了。细胞培养的成功率为50％，切牙培养的成功率为100％，犬齿的成功率为0。

　　（2）细胞增殖和形态学性能：从原代培养的第7天到第14天，用倒置显微镜观察在组织块周围游动的细胞。细胞围绕组织块为中心扩展，并且还可以看到没有组织块的单个细胞簇。细胞为纺锤形，星状或多边形，突起细小，细胞体丰富，细胞质清晰，细胞核呈圆形或椭圆形。单元径向地和螺旋地布置。在约30天的原代培养中，当细胞融合时，细胞达到烧瓶底部的80％至90％并通过1：2。小型猪的牙周膜细胞在传代后生长迅速，可以在4-6天后再次传代。不同的细胞类型对胰蛋白酶的敏感性不同。纺锤形的成纤维样细胞可在3-5分钟内消化，而形态不会改变。上皮样细胞对胰蛋白酶较不敏感，并成簇生长。牙周膜成纤维细胞可通过细胞传代与上皮样细胞分离。

　　（3）免疫化学鉴定结果：在光学显微镜下通过免疫组织化学染色观察到第三代微型猪牙周膜细胞。细胞对抗波形蛋白染色为阳性。阳性颗粒均匀分布在细胞质中，细胞核透明。不染色。抗角蛋白染色为阴性，表明小型猪的牙周膜细胞来源于间充质组织。

　　（4）细胞增殖曲线：小型猪的牙周膜细胞的增殖曲线呈S形，具有明确的保留期，指数生长期和平稳期。接种后24小时内，由于胰蛋白酶消化的作用，细胞数量减少，然后逐渐增加。细胞增殖从第3天开始加速并进入指数增殖阶段，当细胞数量在第8天达到峰值时，细胞在陪替氏培养皿上生长，由于接触抑制而不会分裂，增殖减慢至平台期。