动物造模,充质干细胞 中国实验动物信息网 2020-09-11 458

　　简介：周围神经损伤通常会限制神经再生或导致功能恢复不完全，在再生医学领域中，间充质干细胞（食道干细胞）由于能够分化为特异细胞而被认为是细胞贮存库。 MSCS还分泌具有生物活性的分子，以帮助损伤后建立再生的微环境。鉴于这些特性，间充质干细胞被认为是修复和再生神经损伤的有前途的工具。 MSC疗法的再生潜力是由顺斜肌效应介导的。与脐带干细胞（bmcs）和脂肪来源的间充质干细胞相比，人脐带延髓干细胞（hucMSC）产生更多的准临床作用。积累的证据表明，hucMSC可以促进周围神经损伤后的轴突再生。郭等人报道，hucMSCs的移植通过顺斜动作促进轴突再生和周围神经修复的功能恢复。此外，hucMSC还可以通过其免疫抑制能力降低移植动物模型的同种异体或异源免疫反应。因此，hucMSC分泌可溶性因子，通过顺斜机理促进和支持组织修复，并在再生医学中起重要作用。细胞外囊泡（EVS）是*近发现的间充质干细胞的准临床机制之一。电动汽车包括外泌体，微囊泡和凋亡小体。这些是不同类型的细胞（例如干细胞）分泌的纳米膜片段。 EV将多种蛋白质，脂质，细胞因子，转录因子和其他生物物质传递给靶细胞。它们对冷冻和融化过程具有抵抗力，避免了与骨髓间充质干细胞移植相关的问题，并且免疫原性低，因此可以用于同种异体治疗。源自MSC的电动汽车易于存储，高度安全，并且在再生医学中具有巨大的潜在应用。*近在动物模型上的研究表明，EV作为无细胞疗法具有巨大的潜力。 MSC-EV治疗可以增强缺血性中风大鼠的功能恢复，并促进轴突重塑，神经发生和血管生成。用源自人骨髓基质细胞的EV治疗可以改善中风后的神经再生，并防止缺血后小鼠的免疫抑制。我们先前的研究表明，BMSC衍生的EV促进坐骨神经挫伤大鼠的神经再生。然而，尚未研究hUCMSC-EV对坐骨神经横切的作用。在这项研究中，建立了坐骨神经横断的大鼠模型。我们已经观察到，hUCMSC-EVs可以改善运动功能恢复和神经再生缺陷，并减轻神经支配的肌肉萎缩。 hUCMSC-EVss积聚在神经缺损中，下调促炎性细胞因子（白介素[IL] -6和IL-1β），上调抗炎性细胞因子（IL-10）。 hUCMSC-EV可能有助于坐骨神经缺损大鼠的神经再生。因此，hUCMSC-EVss是用于神经横断后神经再生和周围神经损伤治疗的非常有前途的策略。

　　材料和方法：3-4周大，重220-230克，雄性SD大鼠。 hucMSC的分离和表征：根据上述方法分离并培养人脐带间充质干细胞（hucMSC）。在这项研究中进行的实验使用了3至5代的huc MSC。如上所述，执行茜素红和油红O染色。这些实验表明，hucMSC具有区分骨形成和脂肪产生的能力。藻红蛋白（PE）结合抗CD14、CD19，CD34、CD45、CD73和CD90的抗体用于通过流式细胞仪检测hucMSC在不同通道中的典型表面标记。 H UCMSC-EV的分离，纯化和鉴定：将人脐带间充质干细胞（hucMSC）培养至80％至90％的密度。如前所述，通过超速离心收集培养上清液以分离EV。使用BCA蛋白检测试剂盒确定EV的蛋白质含量。使用Nanosight LM10系统评估了hUCMSC-EV的粒径分布。

　　如前所述，我们使用透射电子显微镜（TEM）识别hUCMSC-EV的形态。将过滤的EV重悬于PBS中，培养并用20μL直接荧光抗体CD63染色以检测hUCMSC-EV的典型表面标记。干净的EV用作NCS。用bd-accuri-c6流式细胞仪分析EVS表型。 hUCMSC-EV的手术和治疗：大鼠腹膜内注射10 mg/kg甲苯噻嗪和75 mg/kg氯胺酮。暴露并去除左坐骨神经（3毫米）。神经的收缩会产生5毫米长的间隙。通过简单的10-0尼龙直接缝合线通过近端神经管和硅橡胶管连续固定近端和远端。将远端和近端神经残端插入1毫米深的管中。确保有5毫米的间隙。用4-0尼龙缝线缝合心肌和肌肉层。连续缝制缝合皮肤。诱导动物模型后二十四小时，将100μghUCMSC-EV（100μl）0.2 ml PBS或0.2 ml PBS注入大鼠尾静脉。将48只雄性SD大鼠随机分为hUCMSC-EVs组（接受hUCMSC-EVs注射的大鼠，n = 24）或对照组（接受PBS注射的大鼠，n = 24）。正常对照组包括三只未进行手术或治疗的大鼠。功能评估：根据上述方案，在手术前和神经发生后2、4、6和8周进行步行轨迹分析。简而言之，用黑色墨水浸泡大鼠的后腿。接下来，向鼠标展示纸上的标准行走路径（30 x 7厘米）。根据以下公式计算坐骨神经功能指数（SFI）：SFI = 118.9（ETS-NTS）/NTS-51.2（EPL-NPL）/NPL-7.5、 E和N分别代表实验和正常，ETS代表从实验大鼠开始的第五个脚趾。TS表示正常的腿伸，EPL表示用于操作的实验性腿长，NPL表示正常的腿长。

　　通常，0对应于正常函数？ 100表示功能完全丧失。肌肉称重：在手术后8周对大鼠实施安乐死。解剖腓肠腹肌并用电子天平称重。腓腹腹肌湿重比的计算公式为手术侧/正常侧×100％。苏木精和曙红染色：收集大鼠神经管和腹膜肌肉，在4°C固定4％PFA固定在石蜡中。准备植入物中央部分的纵截面（12μm厚）和横截面（4μm厚），并用苏木精和曙红（H＆E）染色。免疫组织化学分析：损伤后3天对神经组织切片进行抗原搜索。用1：200稀释的单克隆抗IL-6抗体，1：500稀释的单克隆抗IL-1β抗体或1：100稀释的单克隆抗IL-10抗体封闭培养玻片。将载玻片与以1：300稀释的抗小鼠IgG-Western芥末过氧化物酶孵育。用尼康Ti-S显微镜观察图像。使用Image-ProPlus软件确定IL-6、IL-1β，IL-10的平均密度。透射电子显微镜：手术后四周，切除修复的神经组织的中点并用透射电子显微镜进行分析。如上所述，准备组织切片并在透射电子显微镜下观察。计算每个切片中的髓磷脂片数和髓鞘的厚度。免疫荧光：一种测量神经纤维形态和髓鞘重塑的免疫荧光方法。兔抗大鼠S-100（绿色）（1：100稀释），兔抗大鼠NF-200（红色）（1：100稀释），含有兔抗大鼠髓鞘碱性蛋白（MBP）的神经组织石蜡切片） （绿色）（1：100稀释）或小鼠单克隆抗Brdu（红色）用于封闭和标记（1：100稀释）。对于二抗，请使用Alexa Fluor488山羊抗兔抗体（1：400稀释度）或Cy3山羊抗小鼠抗体（1：300稀释度）。通过以400x放大倍数计算10个随机选择的再生神经组织切片的每个视野中髓鞘轴突的数目，确定骨髓鞘重塑。通过共聚焦显微分析，确定了远端神经残端方向标记EV，以检测特定的Schwan细胞（SC）标记S-100。封闭切片，用兔抗小鼠S-100（绿色）（1：100稀释度）标记，Alexa Fluor488山羊抗兔抗体（1：400稀释度）用作二抗。 hUCMSC-EV的随访：用DIR标记人脐带MSC来源的细胞外囊泡（hUCMSC-EV）的悬浮液，通过超速离心将其重悬，将溶液沉淀并用PBS洗涤两次。给动物模型静脉内注射100μgDiR标记的EV。注射后二十四小时，将大鼠麻醉并在体内成像。 IVIS光谱成像系统用于检测标记的EV在大鼠中的分布。结果：hucMSC和hUCMSC-EV的典型特性：初始培养10天后，附着的细胞变成长梭形，定居并达到融合状态。如茜素红和油红O染色所示，间充质干细胞显示出多种谱系分化成骨和脂肪细胞的潜力。在荧光激活细胞分类中，CD73和CD90细胞呈阳性，而CD14、CD19，CD34和CD45细胞呈阴性。这些数据表明，hUCMSC是根据国际细胞治疗学会定义的标准有效产生的。通过透射电子显微镜，纳米粒子跟踪分析（NTA）和流式细胞仪评估分离和纯化的电动汽车。透射电子显微镜已经表明，hUCMSC-EV是典型的杯状圆形膜颗粒。 hUCMSC-EV的直径为80-650纳米，NTA记录的平均值为168纳米。流式细胞仪分析表明，大多数人hUCMSC-EVs表达特异性标记CD63、这是EV的代表性标记。如上所述，已经成功地分离并表征了hucMSC及其对应的EV。

　　HUCMSC-EVs治疗可改善坐骨神经功能恢复：建立大鼠坐骨神经横切模型以研究hUCMSC-EVs对坐骨神经缺损的影响。图2a显示了RAT模型的构建以及hUCMSC-EV的收集和处理。图2b显示了hUCMSC-EV或PBS处理后的实验过程示意图。使用步行轨迹分析方法评估大鼠运动功能的恢复。 SFI用于确定hUCMSC-EV和对照组的改善程度。图3a和3b所示的步态轨迹分析结果表明，PBS组显示出神经功能的恢复，而hUCMSC-EVs治疗组显示出功能恢复的改善。坐骨神经横断后八周，hUCMSC-EVs处理的大鼠的步态轨迹与正常大鼠相似。术后四、六和八周，与对照组相比，hUCMSC-EVs组的SFI评分显着提高。这些结果表明，应用hUCMSC-EVs可以改善坐骨神经横断后运动功能的恢复。 神经再生的形态学分析：diaphragm肌横切后八周，在坐骨神经中部观察到再生神经形态。导管已完全拔出，切除的正中神经的两段相连。结果显示，hUCMSC-EV和对照组均显示神经原性。实验组的大鼠比对照组的大鼠再生更大的神经。

　　具体而言，H＆E染色显示，hUCMSC-EVs组中再生神经纤维的直径明显大于对照组。 S-100是SCS的表面标记，包裹神经纤维以形成髓鞘。免疫荧光染色显示hUCMSC-EV和对照组中出现S-100阳性纤维。然而，hUCMSC-EVs组中s-100阳性纤维的免疫荧光密度高于对照组。 Brdu染色表明hUCMSC-EVs处理可促进Schwan细胞增殖。术后8周，hUCMSC-EVs治疗组的轴向再生优于对照组。该结果表明，hUCMSC-EV可以促进受损的坐骨神经的髓鞘再生和轴突再生。人脐带MSC来源的细胞外囊泡增加了髓鞘纤维的总数。免疫荧光分析提供了用于检测髓鞘重塑的横截面的中点。图5a显示了神经组织修复的中点。术后八周，进行免疫染色，以检测再生坐骨神经横断面中轴突标记物NF-200和SC标记物MBP的存在。如图5b所示，在hUCMSC-EVs组的切片中主要检测到NF-200和MBP的荧光信号，而在对照组的切片中检测到很少或没有信号。坐骨神经中髓鞘轴的定量显示，hUCMSC-EVs治疗可在轴突截肢后8周增加轴突的髓鞘形成。另外，在手术后4周，与PBS对照组相比，hUCMSC-EVs治疗组中的MBP表达上调。透射电子显微镜显示，hUCMSC-EV处理的大鼠髓磷脂纤维的数量和髓鞘的厚度均高于PBS处理的大鼠髓磷脂纤维的数量。这些发现表明，用hUCMSC-EVs治疗导致在单个轴突周围产生多个轴突和几个SC，而hUCMSC-EVs促进了再生轴突的髓鞘化。建议可能。人脐带MSC来源的细胞外囊泡减少了腓腹腹肌萎缩的程度。当坐骨神经被切断时，腓腹腹肌不被神经支配并减肥。为了评估肌肉神经支配的恢复，我们称重了第8周的腓腹腹肌。 hUCMSC-EV组的腓腹腹肌湿重高于对照组。另外，hUCMSC-EVs组的腓肠肌湿重比高于对照组。这些结果表明，hUCMSC-EVs治疗导致腓总腹肌的广泛神经支配。 H＆E染色显示hUCMSC-EVs组腓骨肌纤维的萎缩减弱。 hUCMSC-EVs组腓腹腹肌的纤维形态与正常肌肉相似。然而，对照组腓骨肌肉的纤维区域减少，提示严重的腹膜肌肉萎缩。人脐带MSC衍生的细胞外囊泡在大鼠神经缺损中积累并调节其炎症反应：间充质干细胞（MSCs）可以存活并可以移植到受损的组织中。

　　因此，我们研究了电动汽车的MSC是否具有类似的归位功能。使用IVISlumina II系统通过荧光成像评估EVS在大鼠中的生物分布。注入大鼠尾静脉后二十四小时，HUCMSC DiR标记的电动汽车聚集在神经缺损中。立即杀死大鼠，并收集神经缺损远端的神经用于组织切片。纵向免疫荧光染色结果显示，DiR标记的EV到达神经缺损的远端。有证据表明，MSC-EVS可以限制导致缺血性脑损伤的缺血后炎症，并且我们还研究了hUCMSC-EV是否调节神经损伤引起的免疫反应。术后3天对远端神经残端进行组织化学染色。与对照组相比，hUCMSC-EVs治疗组促进了炎症细胞因子（IL-6和IL-1β）的下调和抗炎细胞因子（IL-10）的上调。这些结果表明，hUCMSC-EV可以植入神经缺损并调节炎症反应。这种作用可能促进有缺陷的神经的再生。结论：hUCMSC-EV已被证明能够有效促进坐骨神经缺损大鼠模型的功能恢复和神经再生。我们的研究为临床周围神经修复提供了潜力。 hUCMSC-EV的临床应用比干细胞给药更具优势。