动物造模,硬膜外纤维化 中国实验动物信息网 2020-09-11 507

　　背景：组织损伤后，在组织修复过程中会产生并沉积过多的细胞外基质成分，从而形成疤痕。硬膜上疤痕的形成称为硬膜外纤维化。它的存在使再次手术更加困难，增加了手术时间，并增加了硬脑膜撕裂伤和神经根损伤的风险。鉴于腰椎再手术的发生率为4％到19％，这是脊柱外科的普遍问题。为了防止硬膜外纤维化，游离脂肪移植可引起神经根或脊髓受压，但是插入是临床实践中的常见步骤。另外，各种机械屏障和抗炎疗法被用于预防硬膜外纤维化，并且它们的临床成功率不同或受到限制。预防硬膜外纤维化的理想材料应将神经受压的风险降至*低，并且不干扰周围组织的愈合。它还必须具有生物相容性，以*大程度地减少异物反应和炎症。转化生长因子β（TGF-β）在体内各种细胞和组织中起着广泛的作用。 TGF-β1在疤痕组织，特别是系统性硬化症中的表达增加。与组织再生相比，在通过疤痕形成愈合的伤口中，TGF-β1水平升高。这允许临床上使用针对TGF-β1的抗体和小分子来防止疤痕形成。为了评估TGF-β1在硬膜外纤维化中的作用，我们将抗TGF-β1合成肽p144 应用于兔脊柱外科手术模型。 p144在肝纤维化，博来霉素诱导的皮肤硬化和硅树脂假体周围纤维化的动物模型中显示出纤维化减少。在其他研究中，AdconL和Duragen被证明在预防硬膜外纤维化方面非常有效。 AdCON-1是一种由明胶和碳水化合物聚合物（GCP）制成的可吸收凝胶基质，可防止成纤维细胞在3周内消失。 Duragen 是一种胶原蛋白海绵（CS），通常用作硬脑膜植入物，可以渗透成纤维细胞，并利用胶原蛋白基质的孔作为支架形成新的胶原蛋白6-8。一周后它将消失。我们建立了椎弓根切除术后硬膜外纤维化的兔模型，并评估了屏障材料AdconL和Duragen和TGF-β1阻断肽p144对硬膜外纤维化的影响。方法：这项研究使用了40只新西兰白兔（体重4-5公斤）进行L6椎骨切除。创建了四个实验组：对照组，用生理盐水冲洗椎弓根切除部位（n = 10）。在GCP组中，AdconL 均匀分布在椎骨切除部位，覆盖椎骨切除缺损（n = 10）。在CS组中，将Duragen  sheet切开并放置在椎骨切除部位，以适应椎骨切除的缺陷（n = 10）。在iTGFβ组中，p144 肽衍生自人类TGF-βIII型受体序列，并均匀分布在覆盖椎骨切除缺损的椎骨切除部位（n = 10）。在先前的动物实验中已经评估了iTGFβ的细胞毒性。因麻醉或椎骨切除而引起并发症（硬膜破裂，神经受压等）的兔子被列为不合格，不包括在研究范围内。 手术：在L6至L6至L7之间，对动物的黄色韧带从一个茎到另一个茎进行了完整的椎骨切除。手术前12小时禁食所有动物。肌肉注射美托咪定（0.15 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg）给动物镇静。通过静脉注射2-8 mg/kg异丙酚来诱导麻醉，并且在整个手术过程中维持1.5-3％的七氟醚。在麻醉下，动物躺在手术台上的加热垫上。腰ac部用电剪刀修剪，并用聚维酮碘消毒。 L6通过触诊确定，并在棘突中心做一个约7 cm的中线切口。露出骨平面，解剖椎旁肌组织，到达并切开L5和L6之间的黄色韧带，然后从一个茎到另一个在L6和L7之间成45°使用1毫米角度的Kerrison-Rongeur。对茎进行从L6到黄色韧带的完整椎骨切除，形成约20 mm长和约7 mm宽的缺损。手术后，用2/0聚乳酸缝合线缝合心肌。在7天内施用抗生素（青霉素/链霉素0.1毫升/千克/ 24小时）。所有的兔子都被关在一个笼子里，可以自由进食，不需要固定。手术四个星期后，处死了兔子。

　　组织学和组织形态学分析：为进行组织学评估，收集了脊柱，在4％福尔马林中固定1周，并在8周内脱钙溶液（10％EDTA，7.5％PVP），用10 mM Trishcl，PH 6.95固定）。 ）脱钙，用逐步乙醇脱水，并包埋在石蜡中。从每个治疗组的中央和两端取4μm厚的连续切片，并用苏木精和曙红（H＆E），Mason tricolor和siliused染色以评估疤痕组织。使用Zeiss AXIOCAMI CC3相机和AXIO IMAGERM1显微镜收集数字图像。通过组织形态学分析硬膜外瘢痕组织的细胞密度，新骨形成和胶原含量。对于细胞密度，细胞数量是每平方毫米细胞的单位，使用IMAGEJ，每张幻灯片15个区域，每只动物3张幻灯片。新骨形成的面积和椎骨切除所覆盖的距离分别表示为距梅森三重染色部位的面积（mm2）和距离（mm）。两名实验病理学家盲目地对疤痕密度，硬膜外黏附和炎性细胞浸润进行了评分。硬膜和纤维组织之间的粘附性的扩展是He等人。它将根据描述的分类进行分级。粘合密度根据Preul等人使用的分类进行分级。炎性细胞浸润的等级为半定量等级：0（无炎性细胞浸润），1（小于30％的面积被炎性细胞浸润，放大倍数100x），2（瘢痕组织） 30-70％的浸润）炎性细胞浸润，放大倍数为100x）和3（严重的炎性细胞浸润分布在疤痕组织的70％，放大倍数为40x）。

　　统计信息：Graphpadprism 5.0软件用于所有统计分析。统计显着性水平设置为P\u003c0.05、 Kolmogorov-Smirnov用于测试连续变量的正态性。使用单位分散分析来分析治疗组之间的平均细胞密度差异。使用Dunnett多重比较测试来检测每组与对照组之间的细胞密度差异。 Clascal Wallis测试用于分析纤维粘连，疤痕密度，炎性浸润，胶原蛋白含量和新骨形成。我们使用Dunn多重比较测试来比较每个处理组和对照组之间的差异。通过加权κ系数分析所有组的组织学评分。*后，使用Spearman系数评估胶原蛋白含量与细胞数量之间的相关性。结论：两名实验病理学家记录了疤痕密度，硬脑膜粘连和炎性细胞浸润，以确定各种治疗硬膜外纤维化的有效性。对照组和iTGFβ组在血管生成性结缔组织中显示出密集的缺损，从而导致相似的平均疤痕密度评分。在CS组中，缺损的组织密度低，疤痕密度评分明显降低。 GCP组的疤痕密度得分*低，与对照组相比在统计学上显着。观察者在组内关于疤痕密度的一致率为74.6％。比较硬脑膜和瘢痕组织之间的粘附程度，GCP组评分降低，但与对照组相比无统计学意义。 CS和iTGFβ组与对照组之间无显着差异。观察者之间的粘着度课堂上达成的共识是74.6％。与对照组相比，iTGFβ和CS组的炎症细胞浸润评分明显更高。 GCP组与对照组之间无显着差异。炎症侵袭观察者之间的课堂一致性为85.7％。与对照组相比，治疗组的CS，iTGFβ和GCP在细胞密度和新骨形成方面无显着差异。胶原含量通过西里乌斯红染色法测定。与对照组相比，iTGFβ或CS治疗组的手术部位Sirius红染区域比例没有显着差异。另一方面，GCP组的胶原蛋白密度显着低于对照组。

　　结论：动物模型表明，椎弓根切除术后会形成硬膜外瘢痕。 GCP支架可以减少椎弓根切除术后硬膜外腔中胶原组织和细胞的数量。其他治疗方法（CS和iTGFβ）尚未显示可降低硬膜外纤维化或粘连的发生率。这项研究中的数据表明，在兔脊柱外科手术模型中，以这种剂量施用的iTGFβ不能减轻硬膜外纤维化。