动物造模,药效评价,继发肺炎链球菌肺炎 z-bio 2024-07-29 225

　　在对人类疾病致死率排行中，细菌性肺炎和流感位居第6位。动物模型可用来研究流感和肺炎球菌相互作用的机制。

　　1.小鼠肺炎球菌继发感染模型

　　(1)造模方法：使用的肺炎链球菌菌株为D39(血清型2)，WU2(血清型3)，和 TIGR4(血清型4)。小鼠口咽部吸入感染400 pfu的H1N1小鼠适应株influenza A/Puerto Rico/8/34(PR8)(溶于50μl PBS)。病毒感染6d后，再通过口咽部吸入感染5×100 000 cfu的 D39和5×100 000cfu的PspA-，Hyl-or NanA-突变株50μl PBS，肺炎球菌感染24h后，安乐死小鼠，以5ml进行肺组织灌洗，取出肺组织置于灌洗液中进行匀浆，冻存于－80℃。检测肺匀浆中的细菌量。

　　(2)结果：在接种细菌前，小鼠表现出流感病毒感染的症状，如弓背、竖毛和精神萎靡。流感病毒接种7d后，小鼠肺内流感病毒的滴度为10的6次方～10的7次方pfu。预先感染流感病毒的小鼠肺组织中细菌计数远高于未感染者(15000～29000倍)。流感病毒感染6d后再感染肺炎球菌可作为流感后肺炎球菌继发感染的模型，用于研究流感和肺炎球菌相互影响致病作用的机制。

　　2.雪貂模型

　　(1)模型制作：1×10的6次方EID50的流感病毒和1×10的6次方cfu的肺炎球菌以无菌PBS稀释，体积为1ml(500μl/nostril)，雪貂以3.5％异氟烷吸入麻醉，滴鼻感染。雪貂感染流感病毒或 PBS对照，5d后以肺炎球菌D39株感染或滴入PBS。动物分为3个组：流感病毒，肺炎球菌，或先以流感病毒后以肺炎球菌感染，每组两只动物。观察临床症状，并在0，6h，24h，36h和48h采集血样和鼻腔冲洗液。采集鼻腔冲洗液时，以1ml PBS注入雪貂鼻腔(60mg氯胺酮肌内注射麻醉)，并回收。以MDCK细胞滴定鼻腔冲洗液中的流感病毒，肺炎球菌菌落计数以加入3％(vol/vol)绵羊红细胞的大豆胰蛋白酶琼脂平板培养。肺炎球菌感染48h后，安乐处死雪貂。取出肺，固定于10％中性福尔马林。常规制片观察。

　　(2)结果：感染流感的雪貂表现出流涕，活动减少等流感的典型症状，而只感染肺炎球菌的雪貂不表现出流涕或其他呼吸道症状，也没有活动减少。流感病毒攻毒后又感染肺炎球菌的雪貂比单独感染者表现出更重的疾病状态，表现为共济失调，拒绝玩耍及严重的昏睡状态。36h内，感染流感病毒并继发感染肺炎球菌的雪貂白细胞计数增加了82％，从8.2×10的9次方/L上升至14.9×10的9次方/L，并出现核左移。单独感染的雪貂白细胞计数没有明显的变化，但单独感染流感病毒的雪貂白细胞计数高于单独感染肺炎球菌者。先感染流感病毒后又感染肺炎球菌的雪貂的鼻腔灌洗液中肺炎球菌的滴度比单独肺炎球菌感染者高2～3个 log值，流感病毒的滴度与单独感染流感病毒者相近或稍高。所有雪貂的肺部病理改变均较轻，肺炎球菌培养阴性。但也有一些特别的发现，只感染流感病毒的雪貂肺肺泡间隔增宽，间质细胞增加，肺泡上皮细胞增生，只感染肺炎球菌的雪貂表现为以中性粒细胞为主的炎细胞浸润(图30-1)，感染流感病毒后又感染肺炎球菌的雪貂表现为细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的增生和肥大，上皮细胞纤毛减少，肺泡腔内渗出，以及单核细胞和中性粒细胞的浸润。感染流感病毒后继发感染肺炎球菌的雪貂临床症状比单独感染者严重，白细胞计数增加，鼻腔灌洗液细菌滴度也较高，而肺部病理改变较轻，提示先感染流感病毒后感染肺炎球菌的雪貂可能先发生上呼吸道的感染。

　　大多数人流感病毒如果不经适应，难以在小鼠体内繁殖，因此，不能用小鼠研究某种特定病毒与细菌的协同作用，雪貂可能感染人流感病毒的非适应株，而且也可感染肺炎球菌，可用作流感后继发肺炎球菌感染的模型。