动物造模,药效评价,干眼模型 z-bio 2024-07-02 172

　　1．手术摘除泪腺、哈氏腺(Harder’s腺)及第3眼睑制作泪液缺乏型兔干眼模型  手术摘除泪腺、哈氏腺及第3眼睑的具体操作方法：新西兰大白兔，术前连续3d双眼滴抗生素眼液，3％戊巴比妥钠40mg／kg行腹腔麻醉，固定于实验台，术眼常规消毒、铺洞巾；将眼球向前推挤，在眼窝后壁处寻找泪腺，完整摘除；在第3眼睑的内侧面可见哈氏(Harder’s)腺的总导管，顺着导管逐渐、完整的分离Harder’s腺，腺体分2部分，靠背侧前方较小的一部分色白，靠腹侧后方较大的一部分呈淡红色，总长约2cm，完整摘出第3眼睑及Harder’s腺；术毕点抗生素、激素眼液及眼膏。

　　兔泪膜成分与人相近，泪腺是泪膜水液层的一个重要来源，哈氏腺有类似睑板腺及皮脂腺的作用，第3眼睑对眼表具有保护作用，因此摘除泪腺及哈氏腺，可致泪液分泌(主要是水液层)下降，并消除第3眼睑对眼表的保护作用而产生泪液缺乏型干眼。Francois等证实了这一方法的可行性。但由于兔的杯状细胞发达，加之此法没有破坏副泪腺，因而干眼的形成往往需要2个月甚至更长的时间，有时甚至不能形成明显的干眼。如果泪腺没有摘除干净，则导致干眼模型制作失败。此外，由于兔的泪腺分布范围广泛，手术损伤大，因而此模型早期泪膜的质量受手术干扰较大。Gibard等对上述方法做了一定的改进。他不摘除泪腺，而是采用1种纤细的探针插入泪腺导管的开口对其进行灼烙，使得泪腺导管封闭，泪液不能排出。此法减少了手术对眼表的刺激与干扰，其效果与泪腺摘除相似，但寻找泪腺导管开口存在一定的困难。国内谢汉平等改进了Francois等的手术方法，在摘除泪腺、哈氏腺及第3眼睑的基础上，用细棉签蘸50％的三氯醋酸涂抹距角膜缘3mm以外的球结膜，待球结膜变白时用生理盐水缓慢冲洗，此法破坏了副泪腺及杯状细胞，使得干眼更容易产生，且程度更为严重。但此法早期对眼表的干扰更大，用50％三氯醋酸烧灼如此大范围的结膜易引起兔眼眼表上皮坏死、感染，最终导致化脓等。郎莉莉等对谢汉平等的方法又进行了改进，用细棉签蘸50％三氯醋酸仅涂抹上、下穹部结膜，稍加缩小了烧灼面积，实验结果仍满意。如果要进行有关促进杯状细胞生长的药物疗效的观察，使用的三氯醋酸浓度过高或烧灼的时间过长，有可能导致杯状细胞彻底受损而观察不到此类药物的治疗效果。也有单纯摘除泪腺而不摘除哈氏腺及第3眼睑制作泪液缺乏型干眼模型的报道，但其成功率更低。

　　2．破坏泪液分泌反射弧制作泪液缺乏型兔干眼模型  Gilbard利用射频探针插入兔三叉神经节，去除兔眼表的神经支配，发现泪液分泌量出现明显下降，泪液渗透压增高，杯状细胞密度下降，表现出明显的干眼改变，其原理可能为：泪腺、眼表成分和它们之间的神经支配构成一个完整的功能单位，其中任何一个环节受到损害，则用以维持正常眼表结构的泪膜将受到影响。此方法的1个缺点是要准确定位到三叉神经节具有一定的困难，此外，如果操作时温度控制不当，有可能同时破坏三叉神经中的运动支。

　　3．应用阿托品抑制泪液分泌制作泪液缺乏型兔干眼模型  泪腺受副交感神经支配，副交感神经的兴奋可以引起泪液分泌增加，而副交感神经受体阻断剂则可导致泪液分泌的明显下降。阿托品是一种常见的副交感神经受体阻断剂。Burgalassi等应用1％的阿托品滴眼液局部滴眼可以很快产生荧光素染色、虎红染色及Schirmer试验下降等干眼体征，但作者仅观察了6d。肖启国等采用同样的方法对此干眼模型进行35d的观察，发现用药后1周左右干眼体征最为明显，随着时间的延长，干眼的表现呈逐渐减轻趋势，说明这种干眼模型不能长时间维持在一个理想的状态。而且整个实验过程中，印迹细胞学检查杯状细胞密度均未出现明显的下降，角膜、结膜及眼睑病理切片检查也未见异常，提示局部滴用阿托品滴眼液短期内难以引起明显的兔眼眼表上皮细胞的损害。因而这种干眼模型不适宜于长期实验观察的研究，在进行干眼药物疗效的评价中，应根据用药时间的长短审慎地选择此模型，以避免假阳性的发生。

　　4．自身免疫性泪液缺乏型兔干眼模型  Zhu等将兔一眼的泪腺切除，在切除的泪腺上皮细胞中培养自体周围血淋巴细胞，5d后，将培养的泪腺淋巴混合细胞液注射至对侧泪腺，以诱导对侧泪腺组织产生自身免疫，2周后诱导产生类似Sjögren综合征的干眼模型。这种方法操作较为复杂，且双侧泪腺同时受损，不利于作自身对照。由于目前市场上用于抗兔的单克隆抗体极少，因此在干眼形成后要进一步进行有关的炎症因子或细胞因子的检查受到一定的限制。

　　5．去势雄兔干眼模型  具体制作方法：将实验兔用0.05g／ml的氯胺酮50mg／kg肌内注射全身麻醉，阴囊皮下加用2％利多卡因局部麻醉，将一侧睾丸由腹腔挤入阴囊并捏紧，勿使其滑动，用消毒刀片将阴囊切一小口，用力挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，切除睾丸及附睾，连续缝合阴囊皮肤后局部涂碘酊预防感染。另侧睾丸及附睾同法切除。

　　大量研究表明，雄激素水平对泪腺和睑板腺分泌功能以及干眼病程中炎症及细胞凋亡过程均起着十分重要的作用。罗丰年等研究表明雄兔去势后可致其睾酮水平降低，泪腺上皮细胞萎缩，腺泡泡状黏液物质消失，结膜杯状细胞减少，致使泪液分泌的质与量改变，眼表上皮干燥失活，泪膜稳定性降低。马轶群等发现雄兔去势3个月后泪液分泌明显减少，角膜干燥、变薄，见点状溃疡，角膜上皮细胞中有散在的凋亡细胞，数量明显高于正常对照组。因此认为细胞凋亡可能是干眼病患者角膜变薄、细胞缩小、死亡的重要原因之一，而雄激素水平降低可能诱导凋亡发生。此模型的优点在于不破坏眼部正常组织，睾丸切除手术技术容易掌握，模型干眼症状明显，模型较稳定、不易反复。