动物模型,心肌梗死 中国实验动物信息网 2020-08-12 634

　　冠状动脉内粥样斑块破裂以及常常伴随之发生的动脉血栓形成是动脉粥样硬化这一漫长而复杂的病生理过程*后的终点，在人类进行的这一过程是很难在任何其他动物身上完全复制出来的。然而，基于近些年来对于不稳定斑块在急性冠脉综合征中核心作用的认识，人们对于理想的动物模型仍然进行了大量的研究，虽然迄今为止尚没有一个模型能够满足我们的所有要求，但现有的模型已经为这一领域的研究进展作出了很多贡献。这里将目前报道的相关模型做一简要介绍。

　　1．实验动物的选择

　　(1)小鼠：由于小鼠模型易于操作，对于小鼠的生理及遗传信息有比较深入的研究，已经有大量的基因敲除和转基因小鼠模型，因此在动脉粥样硬化领域中多数的研究者都喜欢使用小鼠模型，在目前报道的斑块破裂相关动物模型中小鼠模型也占了绝大多数。

　　尽管如此，仍应认识小鼠模型的局限性。在自然状态下，小鼠不会发生动脉粥样硬化。小鼠的脂质成分与人类截然不同，大部分的胆固醇是由类似高密度脂蛋白的颗粒进行转运。另外，小鼠的体重在25g左右，仅约为人类平均体重的1/3000，而小鼠的细胞与人类细胞的大小相近，这就意味着在小鼠冠状动脉的某个切面上的细胞数仅为人类冠状动脉相似切面上细胞数的1/3000。反映在组织学水平，小鼠的动脉内皮细胞直接附着在内弹力膜，动脉壁中层仅有少数几层平滑肌细胞。与人类相比，小鼠的动脉粥样硬化病变常常沿着内弹力膜伸展，中膜的重塑和动脉瘤也比较常见。此外，在小鼠，很难鉴别斑块的侵蚀(内皮细胞的剥落)和纤维帽的破裂。尽管在遗传工程小鼠模型中可以出现典型的偏心型的动脉粥样斑块，但更多情况下形成的是有多个坏死内核、有或没有独立纤维帽的病变。如Calara等指出的，这些病变的破裂可能不能模拟人类的斑块破裂，这就限制了小鼠模型在研究斑块破裂机制方面的应用。

　　除了小鼠和人类在生物学上的差异以外，对于从遗传工程小鼠模型中获得的研究结果进行解释时，也要非常慎重。首先，当应用两种不同的遗传工程模型来研究第三种基因改造的作用时，就可能发生问题。如在不同的动脉粥样硬化的遗传工程模型中研究A型清道夫受体基因的影响：Suzuki等报道在ApoE基因敲除的小鼠，A型清道夫受体基因敲除可以使动脉粥样硬化病变减小60％；而de Winther等发现在ApoE3 Leiden小鼠模型中，该基因的失活反而使动脉粥样硬化病变增大。这种研究结果的差异可能与ApoE在血管壁的作用有关。

　　另一方面，用来建立转基因或基因敲除的不同小鼠品系也存在着遗传异质性，这可能导致经过相同遗传工程处理的小鼠因为遗传背景的不同而产生不同的表型。例如同样进行 ApoE基因敲除的C57BL/6和FVB小鼠，前者形成的动脉粥样硬化斑块较后者大7倍。为此，比较好的方法是选用近交系小鼠进行研究，使研究组和对照组仅有靶基因的不同。在发表相关研究时，必须对模型小鼠的遗传背景进行详细的描述，并且在对研究结果进行评价时也应将这一点纳入考虑。

　　(2)其他动物：在动脉粥样硬化相关研究中，兔是长期以来人们常用的模型动物之一。用含有大量胆固醇和脂肪的食物喂养兔时会形成富含脂质的动脉病变，这种病变具有某些动脉粥样硬化病变的特征。事实上，1990年前，Anitschkow等正是在高胆固醇饮食喂养的兔*早发现了主动脉中胆固醇聚集的现象。食用这种饮食的兔的胆固醇水平可能较人类高出几倍。兔的这种病变从外形上与人类的动脉粥样斑块相似，但含有更多的脂肪和巨噬细胞。

　　在高胆固醇饮食的条件下，多种灵长类动物会形成与人相似的动脉粥样硬化病变。但是，很多灵长类动物都是受保护物种，而价格也非常昂贵，因此目前仅用于一些复杂问题如精神心理方面的研究，在冠心病研究领域不常规使用，仅在进行新疗法的临床前论证时根据药监部门的要求使用。

　　猪是目前*常用的动脉粥样硬化模型动物。猪在正常饮食的情况下就可以发生动脉粥样硬化。用高胆固醇饮食喂养时，它们的血浆胆固醇水平和动脉粥样硬化病变都与人十分相似。比利时白猪甚至会在应激状态下发生冠脉病变导致的心脏性猝死。但是，猪的购买及长期饲养成本高昂，在使用前应充分评价研究的需要。

　　常用的模型动物中，犬和大鼠对动脉粥样硬化缺乏易感性，不适合进行相关的研究。但是近年来出现了一些转基因大鼠模型，可以造成类似人类动脉粥样硬化的病变，今后可能作为模型动物的选择。

　　2．斑块不稳定和斑块破裂模型的建立方法

　　(1)小鼠模型：迄今为止尚无一种统一的模型建立方式，现有的模型都存在某些方面的缺陷，这里根据现有的文献作简要介绍。

　　现有的模型均采用了经过基因工程改造的小鼠，其中主要是ApoE基因敲除的小鼠。

　　1998年，Reddick等报道了在ApoE基因敲除小鼠用镊子夹持主动脉造成血管损伤后在动脉内形成血栓，*次在动物模型中间接发现了斑块破裂的证据。

　　随后Rosenfeld等在老年的ApoE基因敲除小鼠(60周龄)发现头臂干处形成胶原丰富的纤维脂质病变和黄瘤，这些瘤样病变有坏死的内核，并有壁内出血的表现，这种出血可能是由于斑块破裂导致。并且，从42周以后，小鼠的粥样硬化病变呈层状，提示病变可能发生过反复破裂。在以后的研究中，Rosenfeld等又报道在30周龄的ApoE基因敲除小鼠，给予大剂量的辛伐他汀[50mg/(kg·d)]可以减少头臂干动脉斑块内出血和钙化，他们认为这说明辛伐他汀对进展期斑块具有稳定作用。

　　Calara等观察了82只高胆固醇饮食的ApoE和LDL受体基因敲除小鼠，为期12个月，其中3只出现了主动脉斑块的破裂和(或)血栓形成；另外有33只ApoE基因敲除小鼠予常规饮食喂养，观察20个月，18只出现了冠状动脉粥样硬化，其中3只在冠脉的病变中可以看到有血液充盈的管道，提示可能发生过斑块的破裂和血栓。这一模型中，斑块破裂的发生率仅有5％，远远少于人类的实际情况。

　　Williams等用C57BL6/129SvJ小鼠进行ApoE基因敲除，用含有21％猪油和0.15％胆固醇的饮食喂养14个月。大多数小鼠在头臂干向右颈总动脉分支处出现了粥样硬化斑块的破裂和管腔内的血栓形成。在98只小鼠中，有51只发生了头臂干动脉斑块的急性破裂，有64只发生猝死。在所有猝死的小鼠均可发现血管中有血栓形成，发生斑块急性破裂的动物75％血管内有血栓形成，而未发生急性斑块破裂动物未发现血管内血栓。对猝死的分析发现，在发生猝死的小鼠和存活到研究结束的小鼠中出现斑块破裂的比例没有差别，这提示头臂干的斑块破裂不是这些小鼠猝死的原因，作者分析可能是由于同时存在于冠状动脉内的不稳定斑块导致了猝死，而研究中确实有一部分小鼠发生了心肌梗死，但这一点没有明确的证据支持。

　　另一项研究中，在ApoE基因敲除小鼠，在颈动脉外放置硅胶环来造成损伤，形成斑块后局部转入p53基因，促进细胞凋亡，减少纤维帽中细胞及细胞外基质的含量；用去氧肾上腺素造成小鼠高血压后，转入p53基因的小鼠有40％发生斑块破裂。由于掺杂了多种机械及生物干预因素，这一模型可能只适于研究斑块破裂的机械过程，而很难提供关于病生理机制的信息。

　　北欧的一些研究者应用ApoE和LDLR双重基因敲除的小鼠建立了一个心肌梗死的模型。给ApoE-/-/LDLR-/-的小鼠饲喂“西方饮食”，包括玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、可可脂、纤维素、矿物质、维生素、0.15％胆固醇和21％脂肪。6个月后，小鼠的血清胆固醇可达到(27.8±1.3)mmol/L。随后对小鼠施加精神压力或系统性缺氧，诱发可逆的、内皮依赖的缺血，*终可导致50％的小鼠发生心肌梗死(由肌钙蛋白T、心电图和组织学判定)。后来的研究显示，在系统性缺氧前给予凝血酶抑制剂可以减少小鼠心肌梗死面积，提示不可逆的心肌坏死是在*初的缺血阶段触发了血栓形成的过程后发生的。这一模型模拟了临床心肌梗死前促使冠脉闭塞的多种因素及特定的表型变化，包括了冠脉粥样硬化、血管痉挛、血栓形成、典型的心电图改变以及心肌细胞内蛋白的渗漏。这一模型可以帮助理解静止的粥样硬化斑块发展至急性心肌梗死的机制。在这一模型中，小鼠心肌梗死的范围仍然不易确定，因为梗死的发生是散在的，范围较小，只有将动物处死后方可通过组织切片确定心肌梗死的位置，与临床上典型的心肌梗死仍然有一定差距。

　　Takeshi等在2006年发表的文章中提出另一斑块破裂模型。他们将ApoE基因敲除小鼠一侧颈总动脉结扎，饲养4周后再结扎近段放置聚乙烯套囊，然后处死。病理检查发现，结扎导致了颈动脉明显的内膜增生，形成富含脂质及纤维的病变，其中有少量的巨噬细胞、T细胞和成纤维细胞。用聚乙烯套囊处理后，引起了斑块内出血、斑块破裂，血管腔内血栓形成，在几天后可以看到内膜纤维成分的减少、出现凋亡细胞。

　　其他曾经应用的方法包括注射凝血酶造成血栓、应用腺病毒或FeCl3处理等，均非理想的模拟斑块破裂病生理过程的方法。

　　(2)非小鼠模型：Rekhter等在1998年报道了一个兔的斑块破裂模型。建立这一模型的目的不是为了研究不稳定斑块形成的病生理机制，而是为了评价斑块的力学特性。在高胆固醇/高脂肪饮食的兔，应用2个球囊导管在胸主动脉制造病变，另一内置的球囊反复充盈、放气造成病变的破裂。这个模型可能适于研究斑块破裂的机械过程，但对于斑块破裂内在的病生理机制很难提供有用的信息。

　　2003年，日本的Masashi等报道了兔的自发性心肌梗死模型。该研究组在已经使用多年的具有冠状动脉粥样硬化倾向的Watanabe遗传性高脂血症兔(WHHL)中，经过历时6年、5～7代的筛选，培育出具有心肌梗死倾向的WHHL兔。对WHHL兔的筛选条件包括：①已发生心肌梗死；②冠脉斑块中富含巨噬细胞；③冠脉管腔的狭窄程度超过其父母一代的平均值加标准误：④血浆胆固醇水平在12月龄时>21mmol/L、在24月龄时>18mmol/L。与WHHL兔相比，WHHLMI兔的血浆胆固醇水平高出1.4倍，冠状动脉狭窄程度明显增加，超过90％的WHHLMI兔有>90％的冠脉管腔狭窄。从11月龄开始，WHHLMI兔就可以发生猝死，在死前记录到的心电图可以发现典型的心肌梗死的图形。直到35月龄，死亡的WHHLMI兔中有97％在组织学上可以发现心肌梗死，与WHHL兔相比，心肌梗死的发生率增加4.1倍。心肌梗死广泛分布于左心室、右心室、室间隔，组织学上可以看到心内膜下、透壁、心外膜下的心肌梗死；在多数WHHLMI兔可以发现陈旧的心肌梗死病变与新鲜病变同时存在，其中陈旧病变常常存在钙化并以心内膜下梗死为主，类似人类陈旧心肌梗死的表现。WHHLMI兔发生的新鲜的心肌梗死通常范围较小，少数在发生*次心肌梗死后就出现了猝死，这些动物可能死于心梗或严重心肌缺血所导致的恶性心律失常。所有心肌梗死病变的相应供血血管都可以发现动脉粥样硬化病变，病变*严重的是LCX，以下依次为LSP、LAD和RCA。在LCX，73％的切面可以看到管腔面积狭窄90％以上的粥样斑块，而管腔面积狭窄超过70％的切面达到97.2％。典型的斑块多位于大的冠脉分支，部分病变是易损的斑块：它们有薄的纤维帽，内部富含巨噬细胞、脂质、钙化物而只有少量平滑肌细胞，可以发现斑块内出血。但尽管如此，在WHHLMI兔并没有发现真正的斑块破裂和血栓形成，这可能有几方面的原因：一方面，单纯存在易损斑块仅仅是斑块破裂的基础，很多其他因素如MMPs、组织因子、Lp(a)等都可能参与斑块破裂和血栓形成的过程；另一方面，WHHLMI兔的喂养环境非常单纯、缺少可能诱发斑块破裂的环境刺激因素；此外， WHHLMI兔的血栓形成过程中可能存在与人类不同的关键环节。作者指出，WHHLMI兔在未来的研究中可能有几方面的用途：①WHHLMI兔存在易损斑块而不发生斑块破裂的事实说明，斑块破裂和血栓形成的发生不仅仅依赖于易损斑块的存在，相关诱发因素的作用同样不可忽视，因此以WHHLMI兔为基础，在动物模型建立中叠加其他影响因素可能更准确地模拟人类心肌梗死发生的病生理过程，转基因兔的产生使这种动物模型的建立成为可能。②WHHLMI兔同时存在陈旧和新鲜心肌梗死病灶，可以模拟心肌梗死后存活患者的情况，对于研究这部分患者的治疗可能提供帮助。③WHHLMI兔可以用于研究抑制易损斑块产生的治疗方法。

　　(3)斑块不稳定和斑块破裂模型的应用：斑块不稳定和斑块破裂模型在急性冠脉综合征、主要是心肌梗死的相关研究中无疑占有非常重要的地位，但迄今为止尚没有一个令人十分满意的模型出现。①现有模型中斑块破裂的发生率差异很大，有一定随机性，有些模型中斑块破裂发生率很低，如Calara的模型中仅5％，与人类的实际情况相差甚远，也无法满足研究的需要。②部分模型中斑块破裂发生的部位有选择性，如Rosenfeld和Williams的模型中，斑块破裂都局限在头臂动脉处，Williams认为这提示在小鼠动脉的这个部位血管壁有很大的张力，这与人类的冠脉斑块破裂的基础可能有差异。③在多个动物模型的研究中都存在一个共同的问题，即在推测有斑块破裂的部位都没有明确的富血小板和纤维蛋白的血栓形成的证据；这一点非常重要，因为人类的心肌梗死和脑梗死都不是由于斑块破裂本身导致的，而是由富血小板和纤维蛋白的血栓阻塞血管引起的。这可能也是Williams模型中小鼠的猝死与斑块破裂无关的原因。在没有血栓形成的前提下，斑块内出血被认为是曾经发生斑块破裂的证据，但这仅仅是一种推测，并不确定，与AHA对斑块破裂的定义有明显的差距，该定义中，斑块破裂是指“纤维帽破裂，其上覆盖的血栓与脂质核心相连续”，其中血栓形成是与斑块破裂密切联系、不可缺少的成分，在缺少这一成分的动物模型中进行的研究、特别是疗效研究，其结论需要慎重评价。④斑块破裂模型中，动物发生的心肌梗死常为反复发生的小面积心梗，与临床多数的急性心肌梗死病例不同，不适合进行急性心肌梗死方面的研究。⑤现有的模型常常需要在喂饲高胆固醇/高脂肪饮食的条件下长时间喂养动物，花费大，喂养困难，大大增加了研究的难度和成本。因此，在心肌梗死治疗方法评价的临床前研究中应用斑块破裂致心肌梗死的模型还为时过早，但应用这些模型进行的研究本身可能为我们对心肌梗死的认识深入提供有用的信息，而随着认识的深入，也有助于形成更加理想的动物模型。