帕金森,大鼠模型 中国实验动物信息网 2020-08-12 880

　　1.造模材料  动物：SD大鼠，雌性，2～3月龄，体重180～220g；药物：6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)，阿扑吗啡，兔抗酪氨酸羟化酶血清，亲和素生物素一过氧化酶复台物(avidin-biotin-peroxidase complex, ABC)试剂盒；器械：大鼠脑立体定向仪，307-4型台式牙钻车，JEM100-SX电镜。

　　2.造模方法  将实验动物随机分为实验组和对照组，经反复行为检测确认其无旋转行为后进行实验：

　　(1)实验组：腹腔注射1％戊巴比妥(30mg/kg体重)将大鼠麻醉后，严格颅平位(前囟与后囟水平高度相差0.1mm以下，颅骨矢状缝两侧旁开4mm处水平高度相差0.1mm以下)固定于大鼠脑立体定向仪上(注意将微量注射器针柄与操作平面保持垂直)，常规消毒后，剪开头皮，剥离骨膜，参照大鼠脑立体定向图谱，确定左侧黑质致密部(substanfia nigra compacta, SNC)和黑质纹状体通路(nigrostriatal pathway)两坐标[①SNC前囟后(5.0±0.2)mm，矢状缝左侧(1.7±0.1)mm，颅骨表面下(7.6±0.1)mm；②VTA前囟后(4.6±0.1)mm，矢状缝左侧(0.9±0.1)mm，颅骨表面下(7.5±0.1)mm]，可根据大鼠体重和头颅大小在规定范围内确定具体坐标并用三棱针标记，用牙科钻小心钻透颅骨(注意勿损伤硬脑膜)，按确定坐标将微量注射器缓慢进针到预定深度，向两点各注射6-OHDA 8μg(溶于4μl含质量分数为0.2％抗坏血酸的生理盐水中，用前临时配制)，注射深度应以针孔斜面中点为参照点(以颅骨下硬脑膜处作为0坐标)，由于存在个体差异，具体深度可视大鼠体重和头颅大小略微变动，并可在一定范围内边上移边注射(范围以不超过0.3mm为宜)，以保证6-0HDA能准确注入预定部位，注射速度为10d/min，留针10min，缓慢退针(2～3min)，术后用牙科胶覆盖钻孔，常规缝合伤口，连续腹腔注射青霉素一周以防止感染。

　　(2)对照组：用上述同样方法向两坐标点注射4μl生理盐水(仅含0.2％质量分数的抗坏血酸)。

　　3.造模原理  6-OHDA是一种去甲肾上腺素同系物，对儿茶酚胺神经元及其末梢具有选择性损毁作用，使黑质的多巴胺(dopamine, DA)合成及向纹状体的输送通路受到破坏，导致儿茶酚胺类递质和乙酰胆碱类递质失衡，从而产生偏侧旋转等一系列类似于人类帕金森病(parkinson disease, PD)症状和病理的特征性变化。

　　4.造模后一般变化  术后1周开始行为检测，应用阿扑吗啡(apomorphine,  APO)腹腔注射(0.5mg/kg)，观察其行为变化，每周1次，连续测试6周，若大鼠恒定转向右侧，且旋转速度＞7r/min，则视为成功PD大鼠模型，若大鼠不出现旋转、旋转方向不恒定、恒定转向左侧或恒定转向右侧但速度较慢(＜7r/min)，则视为不成功PD模型。除旋转行为外，还需注意观察是否伴有震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为。

　　5.造模后生化及病理变化

　　(1)免疫组织化学观测：PD模型大鼠左侧中脑黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)反应阳性神经元较右侧明显减少，与对照组的左侧和右侧比较均有极显著差异，而PD模型大鼠的右侧TH反应阳性神经元与对照组无明显差异。术后2周、3周、4周、6周的成功PD模型鼠TH反应阳性神经元与术后1周相比明显减少，术后3周、4周、6周同术后2周比较亦有显著差异，而术后3周、4周、6周的TH反应阳性神经元之间则无明显差异。

　　(2)电镜观察：透射电镜下可见PD模型鼠损伤侧黑质区部分神经元变性坏死，胞膜破裂或残缺，核仁破裂。部分神经元细胞质内溶酶体增多，线粒体和内质网轻度增生，胞核固缩不明显，呈早期凋亡样改变。一部分神经元则出现染色质致密或凝固成边界清晰的块状物，有些出现细胞器水肿，胞膜不清晰及皱缩，细胞质内有电子致密物沉积，溶酶体消失，表现为晚期凋亡样改变。

　　6.注意事项  实验时选用大鼠体重尽量在要求范围内，选择体重在180～250g的大鼠，这类大鼠耐受力强，头部易被脑立体定位仪固定；黑质靶点的确定，应根据所用的定向图谱及立体定向仪认真调整验证；6-羟基多巴胺应新鲜配制，颜色以橙红色为准；注药速度与留针也很重要；手术器械严格消毒，防止手术感染，手术创伤应尽可能小，严格无菌操作；颅骨钻孔时应注意深浅，一旦有突破感立即停止，防止引起大量出血；微量注射器的针尖部要稍微磨钝，以缩小药剂渗透的范围。

　　术后大鼠应分开，等苏醒后3～5h才能合笼饲养，防止先醒的舔咬昏迷大鼠的伤口。饲养室内尽可能保持大鼠*适温度、湿度。