动物造模,青光眼动物模型 中国实验动物信息网 2021-08-26 872

　　背景：青光眼是神经退行性疾病，病理特征是视网膜神经节细胞（RGC）死亡。在青光眼患者和实验模型中，视网膜神经节细胞经历凋亡。很多研究表明，慢性眼内压（IOP）升高，青光眼的临床特点，细胞凋亡之前，导致胞体大小减少、树突收缩，和RGC树突分支损耗。青光眼树突状结构决定了视觉处理视网膜神经节细胞的功能，树突枝状形态的变化发生在细胞死亡之前，研究树突状细胞的变化是了解青光眼的病理生理学的重点。RGC树突突触位于内网层（IPL）双极细胞的轴突末梢。RGC树突状结构早期的变化可能对突触传递效能有重要的影响。在青光眼RGC功能缺失之前，可能存在功能缺失。然而，很少有研究RGCs和青光眼的双极细胞之间的突触变化。

　　由于成人中枢神经系统的轴突在损伤后无法再生，出生后视网膜神经节细胞轴突的生长会大大减慢。然而，不像轴突，RGC树突是一反应元件。已被证明损伤后树突能增加他们的树突状感受野和发展新的树突分支。*近的报告显示，成人中枢神经系统神经元的树突和突触有可塑性，包括视网膜。例如，在与年龄相关性黄斑变性患者获得的视网膜组织中，在外层视网膜感光细胞和双极细胞之间有新形成的突触的证据。青光眼慢性眼压升高，视网膜神经节细胞发生凋亡和树突退化，RGCs和双极细胞之间增加突触的数量会延迟功能性损伤。为了进一步探讨这一概念的相关性治疗，我们必须首先了解青光眼视网膜突触的变化。我们用烧灼巩膜静脉诱导高眼压青光眼大鼠模型，类似于人类的青光眼。眼压升高后对不同时间点的视网膜内层的突触变化进行检查。

　　结果：眼压升高后内网层突触前囊泡增加：烧灼巩膜静脉诱导的持续高眼压8整周的实验分析。具体来说，手术后1周后眼压逐渐升高从17.2±2.26毫米汞柱的基础升至30.4±2.10毫米汞柱。8周烧灼眼平均眼压为31.2±2.26毫米汞柱。在整个实验中，接受假手术的对照眼保持正常眼压。在每个时间段，通过将荧光金注入上丘进行逆行标记进行视网膜神经节细胞计数。每个时间点在正常对照组约有112000个视网膜神经节细胞。在4周和8周随着眼压升高，烧灼眼睛视网膜神经节细胞逐渐丧失。对正常眼的视网膜神经节细胞的平均数，逆行标记RGCs数平均分别下降84.6%和67.1%。在慢性高血压性青光眼模型确认眼压升高和视网膜神经节细胞损失后，通过突触素免疫标记，进行突触囊泡蛋白的评估。眼压升高后，同对照组相比，IPL OPL 和内层ONL突触素免疫活性增高。钴标记的PKCα，双极细胞的标记，显示IPL*内层的双极细胞之间突触素表达上调。眼压升高后的4周和8周，每一个时间点的IPL突触免疫活性增加。所有时间点*内层的IPL共定位突触素和PKCα也显著增加。钴标记的小白蛋白，无长突细胞标记表明无长突细胞较小程度发生上调。这些数据表明：眼压升高增加视网膜的突触前囊泡，至少8周。这些增长主要发生在内深层IPL（含有双极细胞突触与RGCs）的双极细胞。

　　突触前囊泡与RGC树突共染色增加：确定来源于双极细胞和视网膜神经节细胞之间的突触突触前囊泡是否增加，通过免疫组化染色标记RGCs法分析平贴视网膜。突触素和钙结合蛋白之间存在显著的联合染色，无长突细胞和神经节细胞的胞体染色。同对照组相比，在眼压升高1周、4周和8周时突触素免疫反应性增加。然而，眼压升高后仅在小范围发现钙结合蛋白和突触素信号，与对照组相比并没有显着改变。SMI-32，神经丝蛋白标记，使胞体和树突细胞染色。同对照组相比，眼压升高后1周和4周，SMI-32和突触素的共染色显著增加。在8周，RGC形态改变，胞体呈圆形，细胞有很少的树突。突触前囊泡的增加是双极细胞和RGCs之间突触变化的结果，在眼压升高后1周和4周时显著升高。

　　眼压升高后在特定时间段突触前和突触后囊泡蛋白增加：眼压升高后，为确定视网膜中突触囊泡蛋白的变化，分别采用Western blot方法检测突触前和突触后囊泡蛋白，突触素和PSD-95。突触素，突触前囊泡蛋白显示在眼压升高后直到4周后增加，到8周时略有下降，但是同对照组相比，仍有明显增加。PSD-95，突触后囊泡蛋白在眼压升高后直到4周后增加，到8周时略有下降，但是同对照组相比，仍有明显增加。通过Western blot对突触囊泡蛋白定量分析显示眼压升高增加视网膜突触囊泡蛋白。眼压升高后当RGC损失明显时，突触蛋白增加延续至8周时。

　　眼压升高后减少了RGCs和双极细胞之间带状突触：IPL中带状突触的数目通过透射电子显微镜（EM）观察视网膜切片进行量化。眼压升高之前，在IPL中偶尔会发现带状突触。而眼压升高后，带状突触的数目减少至约3.2/50 μm2

　　讨论：本研究我们发现在慢性青光眼大鼠模型中眼压升高后，视网膜神经节细胞和双极细胞的突触囊泡蛋白增加。双极细胞和神经节树突突触素的表达增加。EM观察到IPL中带状突触数目减少。RGCs和双极细胞之间新形成的突触，他们的形态表明不成熟。慢性高眼压视网膜诱导的神经节细胞丧失在导致RGCs和双极细胞之间试图形成新的突触联系。青光眼双极细胞和RGCs间的突触是重要的，因为细胞死亡主要发生在视网膜神经节细胞。IPL中的双极细胞的突触前蛋白，使用突触素进行分析，在8周的实验中，逐步增加。而视网膜神经节细胞的突触后囊泡蛋白，使用PSD-95分析，在前4周先增加，后直到8周逐步下降。这可能是由于眼压升高后至8周时显著的RGC损失。