疾病动物模型,豚鼠实验性变态反应性神经炎模型 中国实验动物信息网 2021-03-08 448

方法

　　1　牛坐骨神经髓鞘碱性蛋白(MBP)的提取与鉴定　①MBP的提取：根据London的方法加以修改。取新鲜牛坐骨神经100g，无菌下分离干净，剪碎，加适量预冷(-4℃)的氯仿/甲醇(2∶1)，高速分散器匀浆，匀浆液加氯仿/甲醇(2∶1)混合液至1000ml，4℃下搅拌12小时，布氏漏斗抽滤脱脂，在沉淀物未抽干前，取出沉淀物再加氯仿/甲醇(2∶1)混合液500ml搅拌2小时，同法抽滤2次，取沉渣加预冷(-4℃)的丙酮500ml，搅拌2小时，抽滤并重复1次。沉渣加双蒸水1000ml，搅拌12小时，抽滤并重复1次，4℃下离心(12500g/min×10min)，去上清液，用180ml双蒸水溶解沉渣，用1mol/LHCl调pH值至3.00，搅拌60分钟，4℃下离心(12500g/min×60min)。取上清液用蒸馏水透析过液，然后用聚乙二醇(PEG：分子量20000)浓缩，置-60℃冰箱内保存备用。上述全过程均在冰浴中进行。②MBP的鉴定：用考马斯亮兰染色法测定蛋白质浓度；用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳法观察蛋白条带。

　　2　MBP诱导EAN　取MBP溶液(3mg/ml)1ml，完全福氏佐剂(CFA：含75mg/ml的卡介苗0.5ml，不完全福氏佐剂1.5ml)，置乳钵中碾匀乳化，多点注入豚鼠背部皮下，MBP用量为300μg/只。

　　3　EAN发病评分标准　结合国际上EAN评分标准，将发病程度分为0～5级。0级：无异常；1级：两后肢脚趾轻微拖拽地面；2级：两后肢脚趾较明显拖地，但未累及其它部位；3级：两后肢显著拖地，常见两后肢偏向同一侧；4级：两后肢完全瘫痪；5级：四肢均受累，甚至呼吸抑制。

　　4　病理形态学观察　①神经组织的HE染色：豚鼠断头处死，迅速取大脑、小脑、脊髓、脊神经根及坐骨神经等，做HE染色。②甲苯胺蓝染色显示神经髓鞘：豚鼠断头处死，取坐骨神经做甲苯胺蓝染色。③单根神经纤维标本的制作：神经组织用10.0%的福尔马林固定，再用1.0%的锇酸固定，在解剖显微镜下撕单根神经纤维光镜下观察。

　　5　运动神经传导速度(MNCV)及复合肌肉动作电位的记录　①电极放置位置：近端刺激电极插入坐骨结节附近，远端刺激电极插入踝关节上0.2cm肌肉内，记录电极一支插在掌面肌肉内，一支插在小趾掌趾关节附近，接地电极插在大腿表皮下。②记录方法：豚鼠麻醉，先记录近端复合肌电(PCMAPs)，调整近端刺激电极位置，以持续时间0.05ms、强度35V的刺激能诱发出肌电时的电极位置为*佳，增强刺激强度，至诱发出*大PCMAPs时，再将刺激强度加大50.0%，以此值作为刺激电压值，连续刺激15次，对所诱发的PCMAPs进行摄影并将15次波形重叠在1张胶片上，以重叠*多处为标准，算出PCMAPs潜伏期及波幅大小。同样方法记录出远端复合肌电(DCMAPs)及远端F-波(即紧接DCMAPs的反射波)的潜伏期。根据PCMAPs与DCMAPs潜伏期的差值及两对刺激电极间的距离可算出MNCV。

　　6　脾淋巴细胞转化试验　采用微量3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法，丝裂原分别为ConA和MBP。

　　7　豚鼠血清中特异性抗MBP-IgG抗体滴度检测　采用ELISA(间接法)方法测得。

　　8　统计学处理　实验数据均以均数±标准差()表示，用t检验作两组间差异显著性的比较。