再生新动脉,完全自体脱细胞 中国实验动物信息网 2020-12-29 520

　　背景：自体血管如隐静脉和乳腺内动脉是作为血管假体的金标准移植物。不幸的是，由于以前的搭桥手术或已有的血管疾病，这些血管并不总是可用或不适合外科手术。当自体血管不可用时，常使用其他人工面部移植。?涤纶和聚四氟乙烯（PTFE）是两种广泛应用于大直径（≥6 mm）移植的合成材料，如用于血液透析的动静脉通路、膝盖以上的外周动脉旁路。不幸的是，由于感染、血栓形成或内膜增生，这些合成材料在用于小直径（<6 mm）移植物时失败。在过去三十年中，组织工程血管移植物（tevgs）被广泛研究，以探索免疫相容性、非血栓性、可生长和可重塑的移植物。许多TEVGs，如细胞接种合成移植物，胶原和纤维蛋白为基础的血管，细胞自组装血管和可生物降解的合成聚合物支架已经开发出来。然而，免疫应答、血栓形成、内膜增生、低机械强度和并发症处理程序限制其临床应用。Sparks等人首次提出了一种利用体内组织工程技术制备TEVGs的新方法。简单地说，在皮肤下插入一根棒，经过一段时间，形成肉芽组织。然后将棒移除，留下可作为血管移植的自体组织导管。这种移植物容易获得，对宿主无免疫力，但由于爆裂强度低、通畅率低而失败。Campbell等人以硅胶管为棒插入并翻转组织囊，以确保内壁覆盖非血栓性间皮细胞。虽然取得了进展，但由于机械性能较差、血栓形成和内膜增生导致的并发症和不满意的通畅率使其不适合临床使用。Niklason和Tedd等人利用人类同种或自体细胞设计去细胞化细胞外基质血管移植物用于慢性血液透析。这些移植物易于制备，免疫相容，适合细胞迁移和生长，可以在小型猪模型中重新植入新动脉。

　　自体组织导管的制备：Teflon管（外径3.9 mm）被裁剪成6 cm长的管段，然后浸入75%的酒精进行消毒。体重25-30 kg的小型猪（n=8，雌性）麻醉前肌肉注射唑拉西泮（5 mg/kg）、甲苯嗪（2.25 mg/kg）和阿托品（1 mg）。用异氟烷诱导镇静，气管插管，用氧气和氮气混合物（1:2 v/v）对动物进行通风，使用以下呼吸机设置：压力控制模式：呼气末正压（PEEP）4cm H2O；吸气峰压16-18cm H2O；呼吸频率12-16次/分钟；潮气量10 ml/kg。通过耳静脉导管静脉注射芬太尼（10μg/kg/h），诱导全麻。麻醉好后，将猪置于动物实验台上，制备腹部皮肤，用0.1%聚维酮碘消毒三次。在水平方向用手术刀切出一个约3cm的小切口，然后用钝性解剖形成一个纵向皮下囊，将管插入该囊中，每头猪4个小切口共插入8个管。4周后，收集周围形成组织导管的导管，取出导管，清除多余组织，取下形成的组织导管，然后将其与1%青霉素和链霉素一起储存在4°C PBS中，以便进一步进行。

　　自体组织导管脱细胞：将制备好的组织导管用PBS清洗3次，然后，在37°C搅拌板上，将它们在8 mM CHAPS、1 mM NaCl、0.12 mM NaOH和25 mM EDTA的溶液中培养2小时，用新鲜的脱细胞溶液重复5次，使其脱细胞。然后在PBS中在搅拌板上将接种物洗涤3次10分钟。在脱细胞过程后，将移植物与1%青霉素和链霉素一起储存在4°C PBS中，以便进一步进行或测试。

　　DNA定量：使用组织用DNA分离试剂盒定量非去极化或去细胞化移植物的总DNA量。首先，用细胞溶解缓冲液和蛋白酶K消化40 mg湿重样品，然后用蛋白质沉淀溶液和离心法去除蛋白质部分。为了分离DNA，上清液加入异戊醇和乙醇，然后离心并用DNA再水化溶液再水化。*后用分光光度计在260纳米处对总DNA进行定量。

　　爆破压力由客户设计的带有压力传感器的流量系统测量。将5 cm长的移植物连接到流动系统，将PBS注入流动系统，并以50 mmHg的增量增加压力，直到移植物失败，通常是由于针孔泄漏或破裂。将*大压力记录为爆破压力。本试验旨在确定从假体上拉出缝线或导致假体壁失效所需的力。

　　与肝素共价连接：肝素通过肝素上的琥珀酰亚胺酯和胶原上的氨基功能之间的交联与脱细胞组织导管共价连接，而琥珀酰亚胺酯则通过EDC和NHS从肝素的羧酸基（hep-cooh）活化。更详细地说，肝素化溶液由溶液A和溶液B组成，其中溶液A用EDC（40 mg/ml）和磺基NHS（20 mg/ml）在MES缓冲液（0.05 M，ph=5.5）中在室温下12小时制备，溶液B用肝素钠（60 mg/ml）在MES缓冲液中制备。将溶液A和溶液B在室温下按1:1的体积比混合30分钟制备新鲜肝素化溶液，用1 M NaOH溶液将pH值调节到7，然后用2μm过滤器消毒。脱细胞移植物浸泡在新鲜制备的肝素化溶液中在室温搅拌板上放置5 h。肝素化后，用PBS清洗移植物。采用甲苯胺蓝染色对肝素连接的移植物进行定性观察。简言之，在0.01M盐酸和0.2%（w/v）氯化钠中制备0.0005%甲苯胺蓝溶液，将肝素连接的移植物在甲苯胺蓝溶液中培养过夜，将无肝素的移植物培养为对照。移植体呈蓝紫色，说明肝素与移植体有关。将肝素连接的移植物裁剪成5 mm长的片段，称重并溶解于5 ml氯仿/丙酮（1:1 v/v比率）中，将溶液在14000g下离心10分钟，保留沉淀，用氯仿/丙酮溶液洗涤沉淀2次，在室温下蒸发有机溶剂，保留从嫁接物中提取的肝素颗粒。然后，将它们浸入8毫升甲苯蓝/正己烷（1:1 v/v比）溶液中6小时，同时将一系列已知浓度的标准肝素在8毫升甲苯蓝/正己烷（1:1 v/v比）溶液中培养6小时。使用平板阅读器在630 nm处测量样品和标准肝素溶液的吸光度。将肝素连接的移植物在PBS中培养，在37°C水浴中摇动12 h，然后进行上述定性试验。

　　猪模型的植入和移植：从手术前3天开始，每天一次服用阿司匹林（5 mg/kg）和氯吡格雷（1 mg/kg）。每天继续服用阿司匹林和氯吡格雷，直至移植物移植。采用上述方法麻醉后，将猪置于背侧位动物实验平台上，在左颈总动脉上方（距中线1.5 cm）划一条10 cm标记线。建立耳缘静脉通道，确保液体注射。所有手术均采用严格的无菌条件和技术。手术刀沿标记线切开切口皮肤，用电刀仔细切开皮下组织，钝性切开分离浅表肌肉，暴露乳突。沿着锁骨乳突与气管之间的间隙，找到颈动脉鞘，用钝性解剖法从周围组织中仔细解剖左颈总动脉。夹动脉前，静脉注射肝素（100 IU/kg），用三硝酸甘油冲洗动脉以避免血管痉挛。用非创伤性血管夹（5.7cm）夹持左颈总动脉，切开两夹之间约5 cm长的动脉，用6-0普勒烯作为端到端颈总动脉的吻合口，间断缝合，植入组织导管（脱细胞和肝素化）。将动物随机分为两组，分别于植入后1个月（n=5）和2个月（n=3）处死动物后取出血管假体。术前用双超声检查通畅情况。静脉注射肝素（100 IU/kg），夹持近端和远端动脉，从左颈总动脉取出植入的移植物。取下的移植物进行交叉分割并用PBS洗涤，然后用福尔马林固定或在-80°C下储存以进行进一步试验。

　　组织学分析：将颈总动脉、脱细胞组织导管和植入后移植物固定在福尔马林和石蜡包埋中，用切片机切割5μm厚的切片。组织学分析采用苏木精-伊红染色、马森三色染色、Verhoeff染色。为了鉴定内皮细胞和平滑肌细胞，用抗von willebrand因子和α平滑肌肌动蛋白进行免疫染色。

　　结果：自体组织导管的制备：外直径为3.9 mm的光滑和未经修改的Teflon管被裁剪成6.0 cm长的管段。将它们浸入75%的酒精溶液中30分钟，然后将消毒管插入微型猪腹部的皮下袋中。皮下植入4周后，在导管周围形成厚而自体的组织导管。很容易收获，几乎没有粘附力。仔细取出多余的组织，取出导管，留下一个自体的、光滑的、厚的组织导管，可以用作血管移植。

　　去细胞和肝素化分析：脱细胞前的组织导管由细胞和富含胶原的细胞外基质组成，细胞应为成纤维细胞，未见弹性蛋白。脱细胞后，很少观察到细胞成分，细胞外基质富含胶原。DAPI染色显示，CHAPS清洁剂能很好地去除细胞成分。脱细胞前后DNA含量有显著差异。非脱细胞、脱细胞和原生动脉的平均厚度分别为324.1μm±57.4μm、525.7μm±119.8μm、637.4μm±50.6μm，脱细胞和原生动脉的厚度无统计学差异。肝素通过磺基NHS/EDC与脱细胞组织导管结合。37℃水浴12h后，与组织导管结合的肝素平均含量为8.2±0.9μg/mg。

　　外科手术:组织导管直径与颈动脉直径相匹配，与颈总动脉吻合良好，作为介入移植，移植体血流通畅，脉搏明显。植入1个月和2个月后，植入物未发生血栓，内膜完整。5只猪进行了1个月的多普勒超声随访。通畅率为100%（5/5），平均内径为3.43±0.05 mm。3只猪在2个月后接受多普勒超声随访。通畅率为67%（2/3），平均内径为2.32±0.14mm。随访1个月和2个月时，两组的内径无明显差异。

　　植入后组织学分析: 植入后细胞迁移到移植物壁上，植入后*个月，移植物壁上形成的弹性蛋白很少，但几乎没有重塑。植入2个月后，移植物壁中的细胞数量增加，移植物壁中也观察到更成熟的波状弹性蛋白。免疫荧光结果显示:在整个移植壁上观察到一个融合的内皮单层覆盖和大量的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性细胞。

　　结论：我们的脱细胞自体细胞外基质血管移植物在小型猪模型中显示出良好的通畅性和良好的原位细胞化和重建，包括相对早期的内皮化和具有平滑肌细胞的群体和良好的机械性能。我们的移植物具有足够的耐用性和通畅性，可用于小直径动脉重建，特别是在外周动脉手术中，并可能在心血管手术中提供多种治疗选择。