SARS-CoV-2,COVID-19 中国实验动物信息网 2020-12-18 493

　　简介：病毒复制后，通常在细胞水平上开始出现对病毒感染的生理反应。病毒进入后，通过多种模式识别受体（PRR）中的任何一种受感染的细胞会检测到病毒的复制。这些受体通过与不同病原体共享的不同结构进行物理结合，充当细胞内外各种微生物的哨兵。在病毒感染的情况下，细胞复制的检测很大程度上由细胞内PRR家族介导，该家族的PRR感知病毒复制过程中经常形成的异常RNA结构。病毒特异性RNA结构的参与*终导致这些受体的寡聚化和下游转录因子的激活（尤其是干扰素调节因子（IRF）和核因子κB（NF-κB））。IRFs和NF-κB的转录激活导致启动了两个常规抗病毒程序。*种是参与细胞抗病毒防御，这是通过转录诱导I型和III型干扰素（分别为IFN-I和IFN-III）和随后上调IFN刺激基因（ISGs）介导的。抗病毒反应的第二个方面涉及募集和协调特定的白细胞亚群，这主要是由趋化因子的分泌来调节。这种广泛的抗病毒反应对病毒施加了选择性压力，并导致了无数病毒对抗措施的发展。因此，宿主对病毒的反应通常是不一致的，感染可造成不同程度的发病率和死亡率。当前的COVID-19大流行是一种严重且发展迅速的全球性健康危机。为了更好地了解该疾病的分子基础，我们试图在各种模型系统中表征对感染的转录反应，包括体外组织培养，原代细胞的离体感染以及来自COVID-19患者和动物的体内样本。我们选择对SARS-CoV-2的转录反应进行表征，并确定其与普通呼吸道病毒（包括A型流感病毒（IAV））的比较。这两种呼吸道病毒编码多种不同的IFN-I和-III反应拮抗剂。对于密切相关的SARS-CoV-1，IFN的拮抗作用可归因于ORF3B、ORF6和核衣壳（N）基因产物。与SARS-CoV-1类似，IAV也编码IFN-I和-III拮抗剂非结构蛋白1（NS1），该蛋白通过结合和掩盖感染过程中产生的异常RNA阻止PRR的初始检测。

　　在这里，我们将SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒的转录反应进行比较，以确定可能构成COVID-19生物学基础的转录特征。这些数据表明，SARS-CoV-2的整体转录诱导是异常的。尽管有病毒复制，但宿主对SARS-CoV-2的应答未能启动强大的IFN-I和-III应答，同时诱导了募集效应细胞所需的高水平趋化因子。因为减弱的免疫反应将使病毒持续复制，所以这些发现可以解释为什么在合并症患者中更经常观察到严重的COVID-19病例。

　　结果：相对于其他呼吸道病毒的SARS-CoV-2转录应答

　　为了比较SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒（包括MERS-CoV、SARS-CoV-1、人副流感病毒3（HPIV3）、呼吸道合胞病毒（RSV）和IAV）的转录反应，我们首先选择了多种呼吸道细胞系的感染作为研究对象。为此，我们从感染细胞中收集poly（A）RNA并进行RNA测序（RNA-seq）以估计病毒载量。这些数据表明病毒感染水平占总RNA读取量的0.1％到50％以上。与其他研究结果一致，我们发现A549肺泡细胞对SARS-CoV-2的复制相对不允许，而Calu-3则相反。推测A549细胞中的低感染率是病毒受体ACE2低表达的结果。为了绕过此限制，我们在A549细胞中添加了表达mCherry或ACE2的载体。在低MOI感染（MOI，0.2）中，外源性ACE2的表达使SARS-CoV-2能够复制。Western blot分析证实了这些RNA-seq数据，显示核衣壳（N）仅在添加ACE2的细胞中表达。此外，对这些细胞的qPCR分析表明，在ACE2存在情况下，包膜（E）和非结构蛋白14（nsp14）的水平比正常细胞高3个数量级以上。值得注意的是，尽管病毒载量急剧增加，我们仍未观察到TBK1（负责IFN-I和IFN-III表达的激酶）的激活，也未观察到STAT1和MX1（IFN-I刺激的基因）的诱导。但通过使用10倍的病毒（MOI，2）可以克服在表达ACE2的A549细胞中缺乏IFN-I和-III参与的问题。

　　为了确定SARS-CoV-2是否对IFN-I敏感，我们接下来用通用的IFNβ处理细胞，并在RNA和蛋白质水平上评估病毒水平。这些数据表明，添加IFN-I导致病毒复制显著减少，这与其他研究结果一致。我们还观察到，当IFN-I信号被JAK1和2激酶抑制剂ruxolitinib阻断时，尽管它显著地阻止了ISGs的诱导，但病毒的峰值水平没有增加。相反，ruxolitinib治疗对细胞因子和趋化因子的诱导作用很小，表明这些基因在SARS-CoV-2感染中的高诱导作用与IFN-I和-III信号传导无关。

　　为了下一步确定这些体外感染是如何改变宿主转录环境的，我们首*行了差异表达分析，比较了感染细胞的条件和它们各自的模拟条件。这些分析表明，允许SARS-CoV-2高度复制的细胞中的转录反应与所有其他受测病毒的宿主反应明显不同。此外，尽管病毒载量相当，但未修饰的A549细胞中的SARS-CoV-2感染与SARS-CoV-1相比显示出独特的反应。HPIV3和RSV组成一个独特的簇，由IFNs和ISGs的高表达表示。有趣的是，低MOI SARS-CoV-2感染的表达ACE2的A549细胞（A549-ACE2）没有显示出明显的IFN-I或IFN-III表达，，而是显示了中等水平的ISGs亚群和独特的促炎细胞因子特征。在A549-ACE2和Calu-3细胞中，SARS-CoV-2的高MOI感染以及6000多个其他差异表达基因中也存在这种特征。此外，尽管病毒复制有显著差异，但这些细胞中的高MOI感染也导致了HPIV3和RSV的IFN和ISG的高诱导。病毒复制水平与IFN产生/信号转导水平之间的差异表明，尽管SARS-CoV-2能够与IFN-I和IFN-III系统结合，但在高MOI条件下无效的拮抗剂可以阻止这种反应。

　　SARS-CoV-2在原代细胞中诱导有限的IFN-I和III反应：

　　鉴于体外细胞培养系统的不同结果，我们接下来试图确定正常人支气管上皮细胞(NHBE) 对SARS-CoV-2感染的反应，而不是单用IFN-I或感染野生型IAV或缺乏抗病毒拮抗剂的突变型IAV (IAVΔNS1)。用IFN-I处理NHBE细胞可显著诱导381个基因，其中大多数在IAVΔNS1感染中也有差异表达，共同概述了这些细胞中强大的先天免疫应答。尽管复制水平不同，SARS-CoV-2和WT IAV的转录反应在数量上相似，但在性质上不同，只有8个共同的显著诱导基因，包括白细胞介素-6（IL-6）、IRF9、ICAM1和肿瘤坏死因子（TNF）。对于IAV，这种抗病毒反应减弱是由NS1的表达介导的，因为IAVΔNS1感染会诱导IFNB和IFNL1-3。尽管完全缺乏IFN表达，但NHBE细胞对SARS-CoV-2的反应仍然引起强烈的趋化和炎症反应，表现为CCL20、CXCL1、IL-1B、IL-6、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL2、CXCL16和TNF的表达。除了适度的IFN-I反应外，NHBE细胞中的SARS-CoV-2还触发了一些独特的途径，包括对IFN-II的反应以及趋化因子信号的显著富集。

　　为了确定目前观察到的对SARS-CoV-2的有限反应是否是细胞培养的副产品，我们接下来在动物体内进行了一项纵向研究。为此，我们选择在雪貂体内进行SARS-CoV-2感染，因为这是一种合适的动物模型。雪貂经鼻感染SARS-CoV-2或甲型流感/加利福尼亚州/ 04/2009，通过鼻腔冲洗，从上呼吸道采集到少量细胞。对这些细胞上进行了RNA序列分析，使我们能够量化病毒载量。感染后1天从鼻腔冲洗液中读取的数据显示病毒复制水平较低，占总读取量的0.006%。感染后三天，病毒复制水平占总读取数的1.2％达到峰值，然后在第7天降至总读数的0.05％，并在第14天完全清除病毒。相比之下，第7天，IAV的亚致死性感染占同一样本类型总读数的<0.03％。鼻腔病毒的存在进一步表明，这些雪貂具有传播病毒的潜力，这与其他人的发现一致。

　　为了表征随时间变化对SARS-CoV-2的反应，将上呼吸道细胞群与经过模拟处理的雪貂进行了比较。在感染后的第1天，我们观察到与病毒检测量相关的转录差异非常小。到第3天，我们观察到以CCL8和CXCL9标记的细胞因子反应的开始，这与细胞培养中观察到的一致。到第7天，尽管病毒水平下降，但细胞因子反应继续扩大，包括CCL2、CCL8和CXCL9等。此外，我们注意到CD163，CD226，CCR5，CCR6，CXCR1，CXCR2和CXCR7中混合白细胞浸润并显著上调。总体而言，与类似的IAV感染相比，上呼吸道中这种转录反应的强度明显较低。然而，尽管IAV诱导了更多的基因，SARS-CoV-2却产生了一种独特的基因特征，丰富了细胞死亡和白细胞活化的基因，包括IL1A和CXCL8等转录物。相比之下，IAV与细胞抗病毒反应相关的转录足迹明显大于SARS-CoV-2，包括IFN标记基因MX1、ISG20、OASL和Tetherin。到第14天，我们没有检测到SARS-CoV-2，并且观察到的细胞因子恢复了基线，但IL-6和IL1RN或IL1RA仍然升高，与MERS观察到的结果相似。

　　*后，为了研究宿主对SARS-CoV-2和IAV的反应如何影响呼吸道，我们接下来进行了平行感染并在第3天检查了气管。在两种感染下，我们观察到病毒水平都很低，但是转录反应很强。差异表达转录的基因富集分析涉及两个免疫细胞特征群。*特征群包括单核细胞和淋巴细胞的共同标记，并且这些基因的诱导在SARS-CoV-2和IAV之间是可比的。有趣的是，SARS-CoV-2感染气管的独特基因特征与造血系祖细胞的基因特征一致，表明感染可能诱导造血。

　　COVID-19患者呈现低IFN-I和-III和高趋化因子特征：

　　在描述了雪貂SARS-CoV-2感染的特征之后，我们接下来试图将这些结果与人类自然感染联系起来。为此，我们首先将COVID-19阳性患者的死后肺样本与未感染者的健康肺组织进行了比较。这些样品的转录谱分析均来自60岁以上的男性（每组n = 2），显示约2,000个差异表达的基因。对SARS-CoV-2反应显著的基因包括一个ISGs亚群，RNA-seq或半定量PCR未检测到IFN-I或IFN-III。除了先天抗病毒免疫的基因外，SARS-CoV-2还诱导趋化因子水平升高，包括CCL2，CCL8和CCL11。尽管分析的患者数量有限，但这些数据证实了我们在NHBE和雪貂中的发现。接下来，我们希望通过直接检测由SARS-CoV-2感染诱导的循环细胞因子，在更多的患者群体中进一步验证我们的发现。为此，我们从Kaiser Santa Clara检测机构的两组人群中获得血清。这两组患者鼻咽拭子检测SARS-CoV-2阳性，或因非COVID-19相关呼吸问题入院（每组24例）。在*初的分析中，这些血清样本的IFNβ和IFNλ始终呈阴性。此外，对单个血清样本中细胞因子和趋化因子的分析显示，COVID-19患者全身炎症增强，其特征是循环中IL-6、IL1RA、CCL2、CCL8、CXCL2、CXCL8、CXCL9和CXCL16水平显著升高。CXCL9和CXCL16（分别是T细胞或自然杀伤（NK）细胞的趋化因子）、CCL8和CCL2（招募单核细胞和/或巨噬细胞）和CXCL8（典型的中性粒细胞趋化因子）的显著升高表明，这些细胞的存在可能是COVID-19患者所观察到的特征性病理学的主要驱动因素。尽管这个样本量不一定代表全部感染COVID-19患者，但我们的数据与我们使用其他模型系统观察到的一致。需要额外的抽样来验证这些发现。

　　综上所述，此处提供的数据表明，在控制病毒复制与适应性免疫应答的激活方面，宿主对SARS-CoV-2的反应是不平衡的。鉴于这种动态，COVID-19的治疗与IFN反应的关系较小，而与控制炎症的关系更大。因为我们的数据表明COVID-19患者中有大量的趋化因子和ILs升高，未来的工作应该集中在FDA批准的药物上，这些药物可以快速应用并具有免疫调节特性。