25-羟基胆固醇 中国实验动物信息网 2020-12-11 742

　　简介：胆固醇在神经元发育和功能的维持中起着重要作用。特别是，它涉及到膜的生物物理性质和突触的生物发生。作为其功能途径的一部分，胆固醇被代谢成不同的天然含氧固醇，包括24-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇和27-羟基胆固醇。24-羟基胆固醇（24-HC）调节脑内胆固醇稳态相关酶的表达。*近发现它在中脑多巴胺能神经发生中起重要作用。另一方面，25-羟基胆固醇（25-HC）是一种更强的甾醇合成抑制剂。它是由胆固醇25羟化酶（CH25 H）产生的，由细胞对胆固醇水平的变化作出反应，也可在感染过程中产生。它是炎症反应的放大剂，对脂质代谢有多种作用。25-HC通过减少胆固醇的合成、增加胆固醇的外排和清除来调节甾醇调节元件结合蛋白（SREBPs）和肝X受体（LXRS）信号通路的活性。氧化型胆固醇的产生增加与几种疾病有关。例如，在阿尔茨海默病患者中，24-HC的水平已经被证明是增加的。事实上，24-HC在阿尔茨海默病发病机制和神经元死亡中的作用已经被充分证明。在神经系统疾病如肌萎缩性侧索硬化（ALS）、视神经脊髓炎和x-连锁肾上腺脑白质营养不良中也发现有高水平25-HC。在病毒感染时观察到25-HC的扩增产物。然而，神经系统疾病和/或病毒感染中神经元损伤/丢失与25-HC之间的联系尚不清楚。有趣的是，一些报道显示25-HC对不同的细胞系如PC12细胞、小鼠CATH、神经细胞系和少突胶质细胞158 N细胞系有毒性作用。这些发现尚待在体内验证。斑马鱼是一种强大的神经发育和毒性研究的模式生物。它们为神经发育和毒理学研究提供了简单、快速、经济、可靠的模型。本研究的目的是利用斑马鱼模型探讨25-HC对活体神经元存活的影响。我们发现25-HC影响早期的神经发育和运动，增加脑和脊髓细胞死亡。

　　斑马鱼：按照标准程序培育和饲养野生型（AB/TL株）、isl1-GFP和huc-GFP转基因斑马鱼。在受精后24小时向斑马鱼孵化水中加入0.003%苯硫脲（PTU），阻断色素形成。25-羟基胆固醇的处理与分析：从受精后4天开始暴露于浓度为2μM、5μM、10μM、20μM、40μM、50μM、60μM、80μM和100μM的25-羟基胆固醇（25-HC）四天。在1μMg/ml下制备25羟基胆固醇，储存于-20℃。在每个试验中，从三个交配池中收集胚胎，并视为n=1.以20个胚胎（n=20）、10个重复（n=10）为批，用不同浓度的25-羟基胆固醇处理胚胎，并对其存活率、孵化率、大体形态和行为变化进行量化。对于成像分析，每个治疗组由7条鱼组成，重复试验3-4次（n=3-4）。观察胚胎存活率和孵化率。对huc:GFP和isl1:GFP在2dpf时的脑神经元形态进行了分析。简单地说，将2dpf斑马鱼在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜，然后使用蔡司LSM780共焦显微镜分析差异。

　　运动活动测量:将20hpf胚胎植入低熔点琼脂糖中，用摄像机记录其在绒毛膜内的运动20 min，在此期间保持其水分。然后使用danioscope软件量化胚胎活跃的时间百分比。在2 dpf时也监测了行为接触反应。简单地说，用一对钝镊子轻轻地触摸斑马鱼幼虫尾部，观察它们对触觉的反应。使用EyoVisual XT 12软件（NOLDUS）进行分析，以量化距离游泳。

　　运动轴索可视化：对2dpf斑马鱼进行免疫组化分析，观察运动神经元的轴突投射。在4°C下，将2dpf的胚胎固定在凹痕（20%二甲基亚砜和80%甲醇）中过夜。固定后，用连续降低的甲醇浓度（75%、50%和25%）对胚胎进行再水化30 min。然后用PBST（0.1%吐温）冲洗几次（1 h）。在此基础上，胚胎在块状溶液（2% BSA和10% NGS PBST）中孵育1小时，并加入一抗（抗乙酰化微管蛋白，1:500），并在4℃孵育过夜。第二天，用PBST（0.1%吐温）冲洗胚胎，并再次封闭1 h（PBST中含2%BSA和10%NGS）。然后加入二抗（Alexa Furor 488，1:1000），并在4℃下孵育过夜。第二天用PBST再次冲洗胚胎（1 h），并将其放置在80%甘油的玻璃载玻片上。使用蔡司LSM780共焦显微镜拍摄Z-Stack图像。

　　mauthner细胞、肌肉和α-银环蛇毒素染色：用免疫组化方法对2dpf斑马鱼进行观察，观察斑马鱼后脑mauthner细胞、肌肉形态和神经肌肉连接处的突触后受体。将胚胎（2dpf）在4℃的4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，固定后用PBST（0.1%Tween）冲洗两次，每次10分钟。在此之后，胚胎在胶原酶（在PBS中浓度为1 mg/ml）中孵育30 min。然后用PBST（0.5% Triton-X）将胶原酶漂洗几次。然后将胚胎在封闭溶液（2%NGS，1%BSA，1%DMSO，1%Triton）中孵育1 h，*后用含有10ug/ml磺基荷达明结合α-银环蛇毒素（分子探针）的PBST孵育30 min。然后用PBST（0.5% Triton-X）冲洗胚胎几次，然后成像。使用Phalloidin染色法显示肌肉，胚胎按上述方法固定，然后在2%Triton X-100/PBS中渗透1.5 h，并在4 C的摇床上在1:20 Alexa-Fluor 488共轭phalloidin 中培养过夜。然后冲洗胚胎并成像。

　　mauthner细胞染色，固定后用PBST（0.5%Triton-x）和dH2O–triton-X (0.5%).多次冲洗胚胎。然后在-20 ℃下同丙酮（100%）孵育10 min。随后，用PBST（0.5%Triton-X）和PBS-DT（1%BSA、1%DMSO、0.5%Triton-X）冲洗胚胎，并在5%NGS的PBS-DT中进一步封闭1 h。将原抗体（抗3A10，1:200）加入到阻断溶液中，在4℃下孵育过夜。第二天，用PBS-DT冲洗胚胎，然后加入二抗（alexa fluor 488，1:1000），并像以前一样在4°C下孵育过夜。用共聚焦显微镜观察胚胎并成像。

　　TUNEL染色：将2dpf鱼固定在4%PFA中，用25、50、75%MeOH在PBST（0.1%Tween）中连续脱水复水，用PBST漂洗数次。用蛋白酶k（10μg/ml）消化胚胎20 min，PBST冲洗，4%PFA固定20 min。接着是2次快速洗涤和3次20分钟的长洗。，然后用PBS再次冲洗，并在TUNEL反应混合物中在37℃下孵育1小时。显微镜下观察。

　　吖啶橙染色：在E3培养基中的48hpf胚胎放置于6孔板的独立孔中，室温下用吖啶橙1x共孵育30 min。吖啶橙原料在1毫克/毫升（100X）的MILIQ水中制备并储存在-20度。然后用E3培养基对胚胎进行3次10 min的洗涤。然后用三卡因处理，死细胞在显微镜下观察。24 hpf和2 dpf斑马鱼也用25-HC（10μM和40μM）孵育过夜，以评估25-HC在主要发育过程对后期的影响。25-HC处理后，评估幼虫的细胞死亡和神经元缺陷。

　　结果：25-羟基胆固醇（25-HC）影响发育，长期高剂量接触时致命：用9种浓度的25-HC 2、5、10、20、40、50、60、80、100μM处理斑马鱼胚胎（2-4细胞期），为期4天，每天分析其存活率、孵化率和大体形态。25-HC暴露对斑马鱼胚胎仔鱼存活率、孵化率和形态的影响如图1所示。与对照组相比，2～40μM25-HC治疗组对24～96hpf胚胎死亡率无明显变化。然而，在高剂量25-HC（50-100μM）时，80μM和100μM治疗组的存活率显著降低，导致2 dpf时胚胎100%死亡。暴露于25-HC处理的胚胎会造成明显的形态缺陷，如弯曲的脊柱和轻度至极度的心包水肿，但在0-40μM时，整个身体大小没有明显变化。40μM25-HC组及以上组织的总形态学缺损率增加。当浓度超过40μM时，胚胎在受精后2-3天死亡，认为不可能用于早期发育研究。40μM浓度的25-HC暴露对孵化率没有显著影响。为了进一步研究25-HC对斑马鱼早期神经系统的影响.在后续研究中，选择了具有代表性的低剂量和高剂量（10μM和40μM），在此剂量下胚胎存活并具有相对一致的发育效应。

　　26-HC对斑马鱼幼体早期运动的影响:为了评估慢性接触25-HC对神经系统的影响，我们首先评估了斑马鱼胚胎和幼虫的运动行为。有趣的是，胚胎的早期自发卷绕呈下降趋势，在40μM处明显较低。在2 dpf中也观察到类似的异常运动行为，其中在10和40μM 25-HC暴露的幼虫的触觉诱发游泳反应中，暴露于40μM浓度的幼虫几乎不移动。在5dpf时，我们观察到10μM25-HC处理的幼鱼运动活性显著降低，而40μM 25-HC处理的鱼则没有运动活性。除运动功能缺陷外，40μM 25-HC处理的斑马鱼幼体运动神经元轴突异常缩短。此外，40μM 25-HC治疗破坏了神经肌肉连接和肌肉形态。我们观察到在每个体节的中间有一个异常的突触后受体聚集。与对照组相比，低浓度25-HC暴露的幼体在运动轴突形态、神经肌肉连接处突触后受体数量和肌肉形态上无显著差异。我们没有观察到mauthner细胞形态的重大变化。这些数据表明，高浓度的25-HC可能对运动系统的早期发育产生严重影响，主要是在运动轴突水平。

　　25-HC改变斑马鱼中枢神经系统发育并导致细胞死亡：我们接下来试图进一步评估25-HC水平升高对中枢神经系统的影响。为此，我们利用了表达GFP的[huc:GFP]转基因系。2dpf幼虫脑的总体结构显示，头部体积减小，脑内神经元数量减少，40μM时比10μM时更明显。接下来，我们使用[isl1:GFP]转基因系检测了暴露于25-HC的斑马鱼幼虫的脑运动神经元。与对照组相比，注射40μM 25-HC的斑马鱼在2dpf时三叉神经（NV）和面神经（NVi）分支运动神经元的位置和数量均显著减少。此外，在这些鱼类中，迷走神经（nx）运动神经元显示出异常的中侧定位和细胞间间隔。尽管暴露于10μM 25-HC的斑马鱼表现出面部（NVii）鳃动神经元群的异常定位，但与暴露于较高浓度25-HC的斑马鱼相比，这些缺陷并不严重。我们还使用一种标记成熟轴突的乙酰化微管蛋白来分析脑轴突。25-HC治疗导致脑轴突数量的总体减少。高剂量时，三叉神经节细胞轴突中乙酰化微管蛋白的染色几乎消失。与未经处理的幼虫相比，25-HC暴露导致脑和脊髓中凋亡细胞显著增加，且呈剂量依赖性。

　　晚暴露于25-HC对斑马鱼的神经发育没有影响:25-HC引起的缺陷是否取决于给药的发育阶段。用25-HC 处理24 hpf和2dpf斑马鱼胚胎，并分别在2dpf和3dpf分析是否有异常。有趣的是，当许多发育过程已经开始或发生时，如果在24hpf或2dpf后注射25-HC，则没有观察到运动轴突特征的显著死亡或改变。

　　结论：我们的研究表明25-HC对斑马鱼的神经肌肉发育、生存和行为有不良影响。这项研究提供了关于氧化胆固醇25-HC对神经和肌肉发育的毒性作用的新信息。然而，还需要额外的试验来完全表征25-HC导致这些缺陷的机理。例如，针对25-HC的结合伙伴，如LXRS，也可以在斑马鱼身上进行基因或药理学测试，以评估25-HC缓解效应的潜力。在评估抑制25-HC的产生是否可能在某些病理状态下起到神经保护作用之前，我们还需要在其他模型系统（如小鼠）上进一步验证我们的发现。