角膜炎症,大鼠模型 中国实验动物信息网 2020-12-04 578

　　背景：类固醇在角膜炎症性疾病中的应用相当普遍。肾上腺皮质激素长期使用能产生眼部副作用如青光眼、白内障和影响角膜上皮。因为这些问题其他抗炎药物正在测试，如生理的丝氨酸蛋白酶抑制剂因子SLPI（分泌性白细胞蛋白酶抑制剂）。这些药物抑制中性粒细胞（PMN）弹性蛋白酶活性，也抑制转录因子NFKB阻碍促炎基因活化的核易位。蛋白酶抑制作用在蛋白酶对炎症部位组织损伤的控制中起重要作用。伤口愈合和炎症性疾病蛋白酶和抑制作用之间的严格平衡是必不可少的。不平衡导致各种炎症性疾病如乳腺增生症、慢性支气管炎、肺气肿。SLPI是一种低分子量的蛋白质，被确定为黏膜分泌的蛋白酶抑制剂。近年来，本实验室研究了SLPI在几种炎症过程中作用。SLPI治疗不易维持，因为其在血清中的半衰期较短。为了提高SLPI生物活性功能，本实验室对其进行了分子水平上的修改。转谷氨酰胺酶（TG）是9个酶组成，催化游离胺和酰基之间异肽键的形成。这些酶参与，如炎症、再上皮化，新生血管和纤维细胞外基质合成的过程。TG2位于细胞核，细胞质基质和膜室。TG2在炎症部位表达，激活磷脂酶A2，NFkB和MAPK刺激炎症反应。它也涉及伤口愈合、翼状胬肉、干眼和过敏性结膜炎等的病理生理学。因此，有一个很强的假设，抑制TG2可能有利于角膜至少在某些点的炎症过程。SLPI基因融合的蛋白酶抑制剂中的N-末端部分，作为一个融合蛋白的重组表达，定为pf-mc。该融合蛋白能锚定在不同的地点的TG2的表达。它允许SLPI分子作用在局部，并可能增加蛋白的半衰期。角膜受伤对眼睛造成非常严重的伤害。造成炎症和释放胶原酶和蛋白酶，严重损害角膜组织。NFKB通路的抑制，被炎性细胞因子激活，可能会减少炎症过程的幅度，促进伤口愈合。为了这个目的，我们的目的是评估上述的融合蛋白对角膜碱损伤大鼠模型的局部效果。

　　方法：36只雄性SD大鼠，12周龄。这些动物经筛选不存在任何的眼病变。采用异氟醚全麻后，在右眼角膜中央部位，使用用1M NaOH碱， 40秒损伤3毫米。然后，眼表用5毫升的生理盐水轻轻冲洗洗。动物根据治疗方法分为三组：1）pf-mc（200μg/ml）；2）SLPI因子（200微克/毫升），3）洗脱缓冲液。治疗局部应用10 UL每天四次。首次给药在造成损伤后30min时。每个组有六只动物分别在病变3，7天时处死。

　　PF-MC制备：pf-mc重组蛋白的纯化与表达在BL21大肠杆菌中制备。细菌的颗粒被溶解，超声、离心。可溶部分的回收和增加一列镍氨三乙酸（Ni-NTA）pf-mc蛋白在柱中加入2毫升50 mM磷酸，300 mM NaCl，250 mM咪唑洗脱；pH=8.减少蛋白质样品的咪唑浓度，用终浓度为2.5 mM磷酸盐缓冲液进行透析。在4°C进行隔夜透析，和随后的蛋白回收和分装以及透析缓冲液。蛋白质pf-mc采用琼脂离心回收。蛋白质浓度的定量用microBCA试剂盒分析。

　　角膜上皮修复时间的评价：通过角膜的荧光染料染色对损伤后的角膜进行角膜再上皮化分析。上皮缺损保留染色区，无染色区域完成再上皮化过程。每一组六只眼用荧光素染色检查，每6小时，在钴蓝色的显微镜下检查。伤后18和24用数码相机拍摄。用Adobe PS图象处理软件规范角膜大小尺寸的彩色区域的像素，计算角膜溃疡的百分比。

　　角膜混浊度评价：第7天，用裂隙灯显微镜观察角膜混浊。简单地说，0级：完全透明角膜没有一丝混浊。0.5级：由斜照明检测到微弱薄雾。1级：轻度混浊但不干扰虹膜的可视性。2级：比较突出的混浊与虹膜轻度遮挡。3级：中等密度不透明，遮挡部分虹膜。4级：完全不透明，前房结构不可见。

　　组织学检查：第3天和7天时，处死动物。摘取眼球，剥离角膜。然后，对角膜进行15微米切片和HE染色。显微镜检查每个角膜的四个部分。角膜的评价包括角膜上皮细胞的形态和层数；间质细胞计数和新生血管定位识别。由两名人员进行分析。新生血管的形成分析。根据角膜示意图从上皮到内皮细胞分类将新生血管分为浅，中，深。新生血管的扩展根据显微领域从边缘到中心的角膜含有血管的数量记录。

　　免疫荧光分析：伤后7天对大鼠进行安乐死，摘取角膜，固定于4%多聚甲醛6h，然后被浸泡在4种浓度的葡萄糖溶液中（5%，7.5%，10%，20%）过夜。用液氮冷冻。15微米厚的切片在4°C同抗小鼠血管内皮生长因子多克隆抗体（VEGF）（1:500）孵育。用驴抗小鼠免疫球蛋白G受体孵育30分钟。使用免疫荧光显微镜进行评价。

　　结果：角膜上皮修复时间的评价：损伤18h后，在pf-mc治疗组动物，出现*只角膜完全上皮化。在24h，pf-mc和SLPI分别出现4只和3只完全角膜上皮化。缓冲液处理的动物没有出现完整的再上皮化所有角膜仍然是不完整的。伤后18小时，pf-mcp处理组动物角膜溃疡面积率明显低于SLPI和缓冲液处理组。

　　角膜混浊度：损伤六小时荧光染料对碱烧伤后显示3?毫米中央上皮细胞对三组的角膜染色。第7天，三组角膜混浊评分差异有统计学意义。pf-mc治疗眼恢复角膜透明性，通过角膜看到清晰的前房结构。但缓冲液处理组，不是所有动物恢复角膜透明性。

　　角膜上皮：伤后三天，pf-mc处理组动物除了一只，其余动物有三层分层上皮。分层程度大于其他动物组。伤后七天，组织学分析显示在所有pf-mc组动物角膜分层至少三层。这些动物的细胞形态看起来相当正常。然而，其他组的动物显示薄的角膜上皮细胞有一个或两个分层。角膜愈合不稳定。

　　角膜基质细胞计数：伤后三天，pf-mc组动物中性粒细胞与总细胞数量减少同SLPI和缓冲液处理动物组相比。伤后七天，pf-mc治疗组比其他治疗组动物角膜基质中的细胞计数要少。

　　角膜新生血管：伤后7天，pf-mc组动物只有浅表血管，而其他组在第3区角膜甚至更深处发现血管。只有缓冲液处理组在第6区甚至更深处发现新生血管。伤后3天, pf-mc组很少显示新生血管，而其他组已出现新生血管。

　　结论：由SLPI转谷氨酰胺酶融合蛋白具有良好的抗炎和局部治疗大鼠角膜碱烧伤模型的抗血管生成的属性。这种融合蛋白被期待用于其他眼部疾病测试。