慢性痛瘢痕动物模型 中国实验动物信息网 2020-12-03 707

　　背景：手术后持久的四肢疼痛或背部疼痛，偶尔会发展成慢性疼痛，影响许多患者的活动和的导致较差的生活质量。为确定引起持续性疼痛的组织病理学和病理机制，我们开发了一个持续痛苦的疤痕动物模型，然后检查疼痛相关的行为和周围组织的病理改变和模型的脊髓神经。

　　方法：大鼠通过广泛剥离后爪足底皮下组织制备动物模型（瘢痕组），在接下来的12周检查疼痛相关的行为。此后，我们进行了瘢痕组织染色、免疫组化染色c-fos（L5背角），和L5脊神经纤维/背根的电镜分析。

　　结果：在同侧足底的瘢痕动物机械性疼痛阈值下降。这种状态维持了12周。瘢痕组织中胶原层发现成纤维细胞呈多。发现同侧神经元的c-Fos阳性面积、在瘢痕组和针孔背角L5水平侧组（假手术）均无统计学差异。然而，破碎的髓磷脂鞘的神经纤维被观察到在同侧L5背根的位置。

　　结论：我们通过对周围组织进行广泛性损伤，建立了一个持续性疼痛的瘢痕模型。观察到皮肤组织纤维化增厚，可能致敏，并对痛性瘢痕相关的脊神经部分降解。该模型使我们能够更好地了解疼痛性瘢痕引起的致敏机制，并探讨人类治疗痛苦疤痕的新方法。

　　介绍：瘢痕形成是一个过程，是创伤和手术切口修复必不可少的。据报道，患瘢痕组织的难治性背痛综合征（FBS）与周围神经功能障碍相关。脊髓减压可普遍减轻持续性腰痛患者的疼痛。在某些情况下，疼痛仍然存在，减压后的神经，提示在疤痕部位的外周神经功能障碍可能会导致慢性疼痛。也被观察到，背部手术后运动神经支配与组肌萎缩，这表明，感觉神经损伤可能发生。另一项研究报道，全髋置换术患者慢性疼痛与术中对神经损伤有关。几种神经损伤的慢性疼痛的动物模型有助于我们了解神经性疼痛的机制。然而，由于缺乏特定的动物模型，目前还没有有用的方法，可以用来了解瘢痕组织的慢性疼痛的基本机制。我们开发了一种痛性瘢痕动物模型可以用来挑起亚急性期的可重复性和可量化的机械性痛觉过敏，持续4周。本研究的目的在12周的时间内使用这种动物模型确定疼痛相关的疤痕组织的行为特征和探讨疼痛的疤痕形成对脊髓神经和背角神经元的影响。本研究采用行为和免疫组化技术研究疼痛相关行为随着时间的推移的变化，周围组织和脊髓神经的病理改变，以及脊髓背角神经元的致敏作用。

　　实验动物：使用26只雄性SD大鼠，体重150g.。动物被饲养在塑料笼里，柔软的垫料，自由采食和饮水。大鼠手术前至少5天适应环境， 并被分为两组（针孔和瘢痕组）。

　　手术：所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）。在瘢痕组（n = 13，脚有痛苦的伤痕），在左足跟用18G针扎针孔（针孔组）。疤痕组是用钢棒在针孔处插入剥离皮下组织创建（= 3mm）。针孔组（为左脚，N = 13假手术），针孔是用18G针在左足跟制成（图1）。任何动物的右侧无外科手术。

　　行为学测试：手术后，大鼠送回原来的笼子里，保持术前时期使用的相同的条件下。为了量化后爪的机械阈值，测量后脚撤退对梯度机械刺激的响应。机械刺激均采用Von Frey细丝。在测试过程中，所有大鼠被放置在一个金属网地板上覆盖一个透明的塑料圆顶（8*8*18cm）, 机械刺激作用于用von Frey细丝每只后爪敏感区。当应用时，在每个灯丝有一个轻微的弯曲以确保在每一种情况下有足够的力。在10s内进行连续10个Frey细丝操作，然后进行一系列的试验，从*薄弱的力量开始逐渐上升。观察到一个显著的撤退视为一个积极的反应，*弱的积极响应视为阈值。所有这些行为测试都在疤痕之前（0天），并每一个星期持续，直到手术后的第十二周。

　　组织学和免疫组化分析的准备：术后12周，所有大鼠给予过量异氟醚麻醉和灌注4%多聚甲醛，0.1 M磷酸缓冲液，pH值7.2，采集组织样本，包括脊髓和双脚。取下的组织标本重新固定在0.1 M磷酸缓冲液4%多聚甲醛，pH值7.2。为了保持样品的形状，组织被浸泡在从5%开始到20%的梯度蔗糖溶液。脊髓和一半的足部样本被迅速冻结，所有的样品用低温恒温器设定切片，厚度为15微米。

　　用TBST（Tris缓冲生理盐水含0.1%吐温20）洗三次后，在室温下样品切片孵育在阻断溶液（4%）2小时。切片再用洗涤缓冲液（0.4%阻断剂含0.1%吐温20）洗三次。随后，4°C用抗c-Fos抗体孵育（1:1000）24小时。 清洗三次后，随后与羊抗兔IgG抗体和Alexa Fluor 546在室温下孵育2小时（1:400）。*后，洗液洗五次，加入含DAPI 的ProLong? Gold Antifad试剂封片。

　　瘢痕和针孔组的六只大鼠均采用免疫组织化学染色。每个动物L5水平脊髓切片。获取所有的断面图像后，对c-fos阳性神经元进行评价。测量同侧或对侧的疤痕或针孔的跖趾关节背角神经元的蛋白表达的地区，对每只大鼠切片用反褶积荧光显微镜检查，利用动态细胞计数软件进行图像分析。为分析c - Fos-IR神经元，脊髓背角的被分为两个部分：浅层（I-II层），和深层（III-V层）。

　　组织病理学：对足进行石蜡包埋，切成厚度为5-10微米切片。所有的组织进行连续切片，对左后肢足底形成的瘢痕组织进行苏木精-伊红（HE）和Masson trichrome染色。对瘢痕和针孔组的五只大鼠进行组织病理学检查。

　　电子显微镜分析：立即切除L5脊神经和脊神经节近端，用刀片切成小块。脊髓神经用2%戊二醛固定，后用 1 % OsO4固定。切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，镜检。

　　结果：疼痛相关行为：用von Frey机械刺激，随着时间推移，产生的痛觉阈值见图。与术前对照值进行比较，在任何时间点无论是针孔组的后爪或疤痕组的后爪的对侧没有明显的阈值的变化。但瘢痕组术后5、9、10周时同侧后肢足爪退缩阈值降低。此外，与同一动物的对侧相比，手术后1，2，3，4，5，6，7，8，10，11，和12周同侧（处理侧）的退出阈值显著降低。针孔和疤痕组之间的比较表明，同侧的后爪和对侧的后爪在所有的手术后的时间点有一个下降的退缩阈值。

　　瘢痕性足底的组织病理学检查：与针孔组相比，瘢痕组的真皮和表皮层变厚，含有较多的胶原纤维。发现胶原纤维束尺寸变化，真皮和皮下区之间的边界不清楚。在胶原纤维之间观察到许多具有圆形或椭圆形核的迁移细胞。与针孔组相比，疤痕组表现出真皮和皮下层的胶原纤维聚集。这些胶原纤维方向随机。疤痕和针孔组的五只大鼠有类似的组织学结果。

　　脊髓背角的免疫组化检查：疤痕和针孔组之间在脊髓背角L5水平板I-II同侧和对侧边的C-Fos-IR神经元区域的蛋白表达无统计学差异。同样，这些组之间在脊髓背角L5水平III-V层同侧和对侧侧的C-Fos-IR神经元地区蛋白表达无统计学差异。

　　神经纤维的电子显微镜分析：对照侧神经纤维正常。没有观察到轴突和髓鞘的退化。轴突的质膜与髓鞘接触亲密。与之相反，有疤痕侧的神经纤维表现出髓鞘碎片，而施旺氏鞘和轴突是完整的。轴突的质膜与髓鞘的没有亲密接触。

　　讨论：皮肤上的一个疤痕被定义为"一个宏观的干扰正常的结构和功能的皮肤结构，由于伤口愈合导致的"。 因此，疤痕是一种不正常的皮肤结构，是一个失败的再生，而不是一个生物力学问题。此外，疤痕被认为是与慢性疼痛有关的因素之一。伤口愈合处P物质和降钙素基因相关肽（CGRP）的密度增加可能与这些伤口愈合的不愉快的感觉症状有关。剖腹术后遭受慢性疼痛的人发现与腹膜粘连P物质和降钙素基因相关肽。已经确定在同侧脊髓背角有P物质和降钙素基因相关肽的调节。关于疤痕侧脚的病理检查显示增生性疤痕，被认为是痛苦的。

　　几种类型的慢性疼痛动物模型已被开发和用于研究慢性疼痛机制的开发和维护。一些慢性疼痛模型，如神经病理性疼痛，肌肉疼痛模型，关节痛和关节固定动物模型双侧脊髓的先前行为及免疫组化研究都显示有痛觉过敏。在这项研究中，同侧的后爪的退缩阈值低于手术前的值。同针孔组（包括同侧和对侧）相同的时间点相比，疤痕组的对侧的退缩阈值下降。

　　结论：我们开发了术后12周，疼痛疤痕、术后痛觉过敏的的动物模型。可能是由于持续的疼痛引起的中枢神经系统的可塑性变化的结果。我们的模型能够更好地了解疼痛的瘢痕引起的致敏机制，在未来，有助于研究治疗人类痛苦疤痕的新方法。