大鼠椎间盘退变疼痛模型 中国实验动物信息网 2020-12-03 720

　　简介：椎间盘是由一个坚韧的外环构成的独特结构，纤维环（AF），以及凝胶状的内芯，髓核（NP）。尽管在椎间盘退变过程有了深入研究，椎间盘源性腰痛的确切机制尚未阐明。椎间盘源性疼痛的许多功能尚未解释，包括少数患者严重的间盘退行性改变，严重的临床感染，慢性背部疼痛。

　　动物疼痛模型对理解疼痛的复杂性和新疗法的开发和测试是必不可少的。通过观察人类的运动和反射的接触，以及通过要求患者报告他们的疼痛的质量和强度进行关节疼痛临床评估。动物疼痛可通过观察：1、疼痛相关的行为，如疼痛或舔或咬的嘶叫，受影响的肢体抖动；2、热或机械刺激的反应。兔椎间盘穿刺模型在椎间盘退变的生物学机制和椎间盘再生实验疗法的研究中是有益的。环形针穿刺后，兔子腰椎间盘逐渐退化。通过常规放射摄影术，磁共振成像（磁共振成像）和组织学检查，定量评估变性。然而，在这个模型中的椎间盘退变过程中兔子往往表现出*小的疼痛行为。当兔子感觉到痛苦，限制了他们的活动，并不能茁壮成长。兔子不显示疼痛行为；因此，它们不适合于椎间盘源性腰痛的研究。由于大鼠敏感的行为反应（例如，发声），大鼠模型已被广泛用于研究慢性炎症和神经性肢体疼痛和镇痛药的药代动力学研究。大多数的椎间盘退变的研究在大鼠尾，而不是在腰椎盘。部分原因是由于其解剖的可及性和*小的外科手术的发病率。大鼠尾部的椎间盘损伤可能会引起疼痛的反应。然而，不同于脊椎盘，尾盘不负重，目前尚不清楚神经解剖结构或参与的构件。因此，解释所产生的伤害性途径是相当困难的。*近的一项研究表明，衡量大鼠疼痛的行为模型可能适合研究椎间盘源性腰痛。他们称盘穿刺针（直径0.4毫米）诱导的大鼠可增加疏导和全身疼痛行为（"湿狗"）摇。在我们目前的研究中，我们试图在间盘结构建立一种新的疼痛和病理变化之间的相关性模型。我们开发的慢性椎间盘源性腰痛，是服从行为痛觉过敏动物模型的评价。我们研究了在间盘组件内的细胞和结构的改变和症状的慢性腰痛发展之间的生物联系。我们也描述疼痛调制器在背根神经节（DRG）和脊髓背部疼痛相关症状。我们进行了药理试验，探索潜在的治疗性镇痛调制的慢性背部疼痛。

　　材料和方法：诱导间盘退化：成年SD大鼠，（250到300g），术前禁食24小时，更容易进行腹刺。动物进行麻醉，氧气（1升/分钟），1.5%氟烷通过面具维持麻醉。使用无菌技术进行手术。动物仰卧位，腹部毛发被剃光，用局部消毒液（葡萄糖酸氯己定）和酒精消毒三次，用手术刀片打开腹腔。腹中线切口约1.5至2厘米，腹部脏器轻轻挪开，观察到脊柱和腰椎的磁盘空间。脏腑灌溉预热无菌生理盐水并覆盖无菌纱布保持组织湿润。诱发椎间盘退变、盘穿刺显微钻（直径0.5毫米和0.25平方毫米的面积，相当于25号针头）插入椎间盘（L4、L5和L5、L6）至深度2毫米。通过使用聚乙烯塞套筒切割2毫米短于钻头的长度。肌肉是用丝线缝合，所有的皮肤边缘用4-0尼龙线缝合。取下麻醉面罩，放回干净笼中饲养。手术后两天，所有动物被注射丁丙诺啡0.1毫克/公斤，每日两次作为术后镇痛。动物进行监测，以确保有没有严重的损伤。另一组动物用一个更大的钻进行间盘穿刺。对于假手术对照组，间盘暴露同实验组相同的方式，但没有穿刺（每组12只）。椎间盘退变的生化，组织学和成像分析在下面的章节中描述评估。采用L5脊神经结扎产生神经性疼痛的动物模型比较椎间盘退变模型的组织蛋白和RNA水平。

　　动物行为学测试：压力测试发声阈值：按0.5-cm2装置提示直接在背部皮肤上刺盘测量基于应力计的力的嘶叫阈，并同假手术对照组得到的阈值相比较。按照100g/s，力慢慢增加直到听到嘶叫。用1000g的切断力以防止组织损伤。进行重复试验，平均值为伤害性阈值。术后检测延迟至术后一周，允许腹部组织愈合。疼痛测试是临床相关的，因为患者的疼痛鉴于间盘上的机械压力测试，以评估他们的背部疼痛程度。

　　机械性痛觉过敏：让大鼠适应钢丝网格覆盖透明塑料笼15分钟，一个校准的冯弗雷丝被应用从足底来确定50%力痛阈。长丝的力量范围从0.04到15克，开始时2克。灯丝被施加到皮肤上有足够的压力，并保持长达六秒。一次轻快的抬起脚被记录为一个积极的反应。

　　检测颈椎病模型的机械性疼痛阈值作为两腿继发过敏指标。从所有腿疼痛试验数据的基础上计算左，右两侧的平均值。

　　运动不协调：大鼠被放置在一个旋转的杆（10rpm旋转性能测试），延迟下跌时间记录其协调和平衡能力。

　　药物治疗：在椎间盘退变诱导七周后开始给药实验，保定大鼠和给予0.5ml的药物溶液腹腔注射（ip）或灌胃（po）测试药物为α2δ1亚型钙通道阻滞剂，普瑞巴林20mg/kg。混合环氧合酶（COX-1和COX-2）抑制剂，ip酮咯酸氨丁三醇20mg/kg。COX-2选择性抑制剂，塞来昔布50 mg/kg口服。μ-阿片受体激动剂，硫酸吗啡6.7mg/kg，ip和赋形剂。每一种药物有三-四天的间隔，*小化避免药物残留影响。由于重复伤害性刺激本身压力痛觉过敏的药物注射后*多四个时间点进行限制局部组织过敏。没有药物剂量造成大鼠镇静或运动不协调。

　　组化和数据分析：处死动物，无菌解剖每个椎体腰椎运动节段。该组织固定在4%多聚甲醛、脱钙乙二胺四乙酸溶液（每五天更换一次）。脱钙的间盘被切断并用石蜡包埋。切成5微米的切片。番红O-固绿染色观察大体形态和软骨蛋白多糖的损失。我们比较所有获取的间盘分级尺度，分数范围从4到12：I类= AF，II类=AF和NP之间的边界，III类=细胞在NP和IV 类=NP矩阵。因为每一类有一个*大的3分，总分为12分（12级）代表严重退化。非盲研究者通过动物分组阅片。然后随机分级。甲苯胺蓝染色观察肥大细胞的一般形态。免疫组化是根据既定的方法采用抗CD11b抗体进行。总之，阻断内源性过氧化物酶，组织切片孵育过夜原代大鼠抗小鼠巨噬细胞CD11b抗体结合。组织切片，然后用二次生物素抗体孵育，其次是培养与链霉亲和素-辣根过氧化物酶共轭和0.5 mg/mL联苯胺。

　　椎间盘影像学分析：使用mx-20标本X线摄影系统对间盘进行高度的测定。在实验的*后阶段，切除腰椎运动节段（L4、L5，L5、L6）拍片。图像被数字化，进行评价和分级。双盲独立测量的磁盘高度。

　　结果：间盘穿刺导致慢性背部疼痛症状：我们以前曾试图用21号钻（直径0.8毫米和0.64平方毫米的面积）不能诱导渐进的背部疼痛，但同假手术组相比，在一周内逐渐产生创伤性压力痛觉过敏反应。通过使用一个较小的显微钻（直径0.5毫米和0.25平方毫米的面积，相当于25级），相比较假手术对照组，在L4/L5盘区旁施加力刺激诱导压力痛觉过敏的缓慢发展的嘶叫阈值。模型显示出强大的椎间盘源性腰痛症状持续的疼痛行为期（术后七周以上）。由弗雷试验机械痛觉过敏试验组与假手术组动物后爪无继发性痛觉过敏。用盘钻穿刺动物表现在直腿抬高试验（经常被用来诊断神经受压引起的疼痛）经常无疼痛反应，如由椎间盘突出引起的。用旋转试验动物在性能上没有变化。

　　椎间盘退变引起的痛觉过敏与盘狭窄有关：在手术后的第九周结束时，对腰椎运动节段进行解剖，并在X射线成像的基础上确定间盘的总高度。一只大鼠所获取的间盘同自身及其他所有大鼠的间盘比较。同对照组相比，在破坏的椎管部位观察到显著的间盘狭窄，约55%出现间盘高度减少。为了排除正常变化，由于老化和/或改变运动造成间盘的损伤可能影响相邻的磁盘，我们在一个单一的动物比较间盘（损伤与术前）。我们的研究结果表明，术前组的间盘的高度与假手术对照组一致。在相邻的磁盘（L2与L3和L3、L4），我们没有观察到显著的变化可能是由于受伤的间盘的影响。在三周的时间间隔重复测量间盘高度两次，，以验证间盘的高度指数的可重复性。椎间高度指数测量仪器误差估计是*小的（组内标准偏差（SW）= 0.003，变异系数为8.5%）。

　　盘穿刺引起的痛觉过敏同间盘形态学变化相关：在手术后九周作间盘标本组织学评估。假对照组（n = 6）和25号针穿刺实验组（n =6）间盘的形态变化在等效部分进行了比较。进行了半定量组织学分析采用分级系统，番红O染色、甲苯胺蓝染色如前所述。对照组显示正常间盘Masuda得分4分。一个完整的AF与正常纤维软骨板模式，AF和NP之间的一个明确的边界，并保存的蛋白多糖含量。相反，实验组显示间盘严重损坏，显著的蛋白多糖消耗， NP大量损失和/或NPS倒塌。术后9周，间盘损伤后显示*高的Masuda得分12分。重要的是，在术后九周时，压力的发声阈值为410±25 G盘穿刺组与对照组958±26 g（P＜0.001），说明椎间盘退变和持续疼痛的相关性。肥大细胞（以强烈的甲苯胺蓝染色显示），在伤口愈合和结缔组织炎性反应中起到关键作用，在间盘损伤处观察到大量肥大细胞。免疫组化分析的基础上通过免疫细胞的特异性抗体，CD11b进一步验证了我们的观察。通过高度增加的CD11b抗体免疫反应表明间盘损伤部位高度的炎症反应。

　　由椎间盘退变引起的疼痛通路可能与神经性疼痛重叠：神经病理性疼痛模型，在DRGs与脊髓背角神经元一组疼痛调节剂上调（↑）或下调（↓）。这些病变的分子包括降钙素基因相关肽（↓），P物质（↓）和脑源性神经营养因子（↑），神经肽Y（↑），甘丙肽（↑）通过星形胶质细胞的活化，从而激活TNFα，MCP-1和TLR4通道。在我们的动物模型中，椎间盘退变后有症状的行为性慢性背部疼痛，在DRG（L4/L5）和脊髓背角我们发现TNFα， MCP-1和TLR4的表达。我们观察到α2δ1表达显著增加，α2δ1一个亚基的电压门控性钙通道参与神经病理性疼痛的途径，在动物脊髓背角与椎间盘源性疼痛在mRNA水平和蛋白质水平均增加。这些结果表明，由椎间盘退变引起的慢性疼痛的途径，至少部分地与神经性疼痛的重叠。神经源性疼痛与椎间盘退变的基因表达谱的综合比较见表。

　　椎间盘退变致慢性腰痛治疗性调节的药物试验：在动物模型中研究药物治疗慢性疼痛的治疗性调制。因为假腹部切口观察到动物并没有表现出任何的痛觉过敏。这表明他们的痛苦经验并不是由于腹部切口，选用大鼠间盘损伤（但不是假手术动物）测试药物，包括吗啡，塞来昔布，酮咯酸和普瑞巴林。包括吗啡作为一种控制原型药物，对某些类型的疼痛是有效的（例如，伤害性，炎症和术后疼痛）。吗啡可以降低间盘初级压力痛觉过敏的效力表明损伤引起的伤害性过程。塞来昔布用于炎症性疼痛的药物，但它对伤害性疼痛（急性）是无效的。普瑞巴林对神经病理性疼痛是有效的对炎症或伤害性疼痛无效。

　　结论：我们的研究结果为未来的研究新的治疗干预措施提供了基础，，可能会改善患者由于椎间盘退变导致的背部疼痛。