大鼠心脏功能 中国实验动物信息网 2020-11-23 477

　　简介：肥胖是一种全球性流行病，肥胖相关并发症如2型糖尿病（T2D）和心血管疾病（CVD）的表现也有所增加。尽管这种增长在本质上是多因素的，但众所周知的危险因素包括久坐的生活方式和不良的饮食习惯，例如增加糖饮料（SSB）的热量摄入。大量的危险因素和不良影响是由于身体不能补偿过量的卡路里消耗而引起的。研究表明，高SSB摄入量与心脏代谢疾病发病的许多危险因素有关，例如内脏脂肪沉积增加、甘油三酯和胆固醇代谢产物升高以及体重增加。各种碳水化合物（如糖和高果糖玉米糖浆）的消耗会导致饮食中的高血糖负荷、炎症和胰岛素抵抗。此外，高SSB消耗会导致血糖和胰岛素浓度升高，从而直接阻碍肝胰岛素信号传导，从而促进胰岛素抵抗。SSB摄入也可能不会引发饱腹感反应，这可能是液体热量升高和健康风险增加之间的重要联系。尽管有证据表明SSB的摄入与心脏代谢疾病的发展有关，但其导致此类并发症的潜在机制仍不清楚。我们通过建立一个独特的体内实验模型来评价SSB的使用效果。在目前的研究中，我们分别调查了3个月和6个月的实际SSB消耗是否会引发代谢失调和线粒体和心脏功能的假定联系。我们特别关注了非氧化葡萄糖途径（nogps）的作用，即多元醇途径、己糖胺生物合成途径（hbp）和pkc在这一过程中的作用，因为这些途径以前与心脏代谢并发症的发生有关。因为nogps是糖酵解的分支途径，对葡萄糖流量的升高有上调作用，从而触发有害的下游途径，从而导致心脏收缩功能障碍。

　　动物和实验方案：体重～250克的雄性Wistar大鼠被分为两组：a、给予SSB；b，给予纯水；时间分别为3个月和6个月（每组n=6）。本品每100毫升含4克蔗糖，即每250毫升含176.7千焦。根据组分配和体重分类，每天用实验剂量灌胃大鼠。使用表面积体积比计算剂量体积，并根据重量进行校正。这里的剂量模拟了60公斤人每天摄入125毫升（54卡路里）的SSB。每周测定动物摄食量、每周给大鼠称重，记录体重增加的百分比，以便对肥胖的发展进行评估。实验程序完成后，对大鼠实施安乐死，获取器官、称重和速冻，并在-80°C下储存，直到进一步分析。

　　采血：动物禁食过夜（至少12小时），然后使用3%异氟醚镇静，然后从右颈静脉抽取1毫升血液。血液离心，取上清，用标准程序评价尿酸、丙氨酸转氨酶（ALT）、血红蛋白A1C（HbA1c）、甘油三酯和总胆固醇水平（mmol/L）。采用不同的方法测定糖化血红蛋白。NGSP系统是应用*广泛的系统，其结果以糖化百分比表示。IFCC法是用高效液相色谱法分离糖化肽和非糖化肽。采用质谱法或毛细管电泳法对各组进行定量分析，结果以mmol/L表示。用回归方程计算EAG，测量单位为mmol/L.使用市售的酶联免疫吸附测定试剂盒测量胰岛素水平。

　　口服葡萄糖耐量试验:*初评估基线空腹血糖水平，将葡萄糖粉溶解于蒸馏水中（0.86 g/kg体重），灌胃大鼠并监测120分钟。在以下时间点5、10、15、30、45、60和120（分钟）获取结果。

　　线粒体呼吸作用的研究：如前所述，用极谱氧传感器在氧气分析仪2K的2 ml玻璃室中测量线粒体呼吸。使用皂苷渗透心肌纤维（~2 mg），并将其放入两个氧描记室，然后在氧通量稳定时测定内源性常规（R）呼吸。丙酮酸脂(5mM)、谷氨酸(10mM)和苹果酸脂(2mM)用于诱导葡萄糖氧化，用辛烷基肉碱（0.2 mM）和苹果酸（2 mM）诱导脂肪酸（FA）氧化.氧化磷酸化（oxphos）通过添加2.5 mM ADP，然后添加2.5μM寡霉素通过抑制ATP合成酶来诱导leak呼吸进行测定。.用解偶联剂CCCP（0.5 M）进行滴定，将呼吸提高到*大水平，称为电子传递系统（ETS）容量。然后将鱼藤酮（复合I抑制剂）添加到0.5M的*终浓度，同时，添加2.5 M抗霉素A可诱导残余氧消耗（抑制复合物III）。*后，滴定0.5 mM TMPD和2 mM抗坏血酸，评估复杂的静脉连接呼吸作为线粒体含量的代表。所有呼吸状态下的氧气流量均归一化为复合静脉流量，以纠正氧描记室中细胞含量的变化。计算过量的E-R容量，以确定ETS容量和R呼吸之间的差异。

　　心功能:实验结束前一周，大鼠用1.5-2%的异氟醚进行轻微麻醉，并将其置于暖垫上的仰卧位置。采用VEVO 2100超声系统和13-25兆赫线性阵列传感器进行了闭胸超声心动图检查。为了评估左室舒张功能，在心尖4室视图中，通过脉冲多普勒获得二尖瓣E和波峰速度，然后计算E/A比。所有测量均在超声系统上安装软件的情况下，在至少三个连续心脏周期的平均值上进行离线测量。对于灌注研究，大鼠使用戊巴比妥钠麻醉（160 mg/kg体重）。心脏被迅速切除，在冰冷（4°C）的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液中滞留，并通过主动脉安装到主动脉插管上。左心房也通过肺静脉插管。首先在恒定静水压（100 cmH2O）下以非循环方式逆行灌注心脏10分钟，然后在工作心脏模式（预加载15 cmH2O，后加载100 cmH2O）下灌注20分钟。心脏没有电动起搏，而心肌温度被恒温控制并定期监测（再灌注时恒定在37°C，缺血时恒定在36.5°C）。然后，通过结扎左前降支近端，再灌注2小时，对心脏进行35分钟的局部缺血。如前所述确定心肌梗死面积。

　　心肌脂肪和葡萄糖代谢：组织甘油三酯水平的评估使用Picoprobe荧光测定甘油三酯定量分析试剂盒。使用市售试剂盒测定心肌糖原和糖原合成酶1水平。

　　结果：体重和器官变化：与对照组相比，SSB组体重增加更多，曲线下面积（AUC）分析显示，三个月和六个月时，SSB组的体重增加显著。两组的饲料消耗无差异，各组织重量（以*终体重的百分比表示）无显著差异。

　　血液代谢产物和OGTTS：测定了禁食后血清水平：尿酸、ALT、HbA1c、胆固醇、甘油三酯和葡萄糖。三个月后SSB组HbA1c检测增加（P＜0.05 vs对照），血清胆固醇水平升高。到6个月时，SSB组的HbA1c（IFCC）仍然升高（与对照组相比P<0.05），而胆固醇水平没有显著差异。六个月后，与对照组相比，SSB组显示较高的尿酸水平。HOMA-IR数据显示，两个实验时间点的SSB消耗量没有显著差异。OGTT数据显示，与对照组相比，SSB组在3个月和6个月时间点的AUC较低。

　　线粒体呼吸：结果显示，在6个月的时间点，各组在葡萄糖氧化测试的各种参数上没有显著差异。使用丙酮酸，谷氨酸和苹果酸作为氧化底物。在检查氧磷、LEAK和过量E-R比值对FA氧化（辛诺基肉碱和苹果酸底物）的反应时，也观察到类似的结果。当添加FA氧化底物时，SSB组的ETS比率显著降低。由于技术问题，三个月的时间点无法生成呼吸数据。

　　体内和体外心脏功能评估：超声心动图分析显示，对照组和SSB组在3个月和6个月后没有显著差异。心脏灌注数据显示，在稳定期和模拟缺血后恢复期间，SSB治疗组和对照组的任何参数均无差异。梗死面积测定显示两组之间没有差异，尽管6个月后SSB组的AR升高。

　　心肌脂葡萄糖代谢：我们评估了几种代谢标志物，以更好地了解线粒体呼吸和心脏功能数据。两组间的心脏组织甘油三酯水平在两个时间点均保持不变。6个月时，SSB组心肌糖原浓度显著降低，但糖原合成酶1水平没有显著变化。

　　结论：综上所述，SSB的摄入量分别为3个月和6个月，不会导致心脏功能障碍或IR/T2DM。尽管如此，但分子水平的早期变化可能会使这种生物体长期处于更高的风险中，特别是在压力条件下。