小鼠试验 中国实验动物信息网 2020-11-19 703

　　简介：巨噬细胞聚集在脂肪组织中，引发慢性低度炎症，促进全身胰岛素抵抗的发展。根据来自体外实验的转录谱和表达标记，巨噬细胞一般被归类为经典/炎症（M1）或交替/抗炎（M2）激活。M1巨噬细胞以高糖酵解速率为特征，而M2巨噬细胞主要依赖于氧化磷酸化。驱动巨噬细胞极化的中心作用已被指定为低氧诱导因子-1α（HIF-1α），它是糖酵解的主要调节因子，它参与了M1表型的发育。脂肪组织巨噬细胞（ATMS）的细胞内代谢的分析，以及涉及的关键调节因子，有望进一步了解它们的代谢功能，*终可能为调节其炎性性状提供靶点。使用不同的方法，我们确定了ATMS在肥胖中的独特的代谢激活，其不类似于M1或M2巨噬细胞。巨噬细胞的代谢激活，其特征是增加OXPHOS和糖酵解，在与脂肪组织共培养时被剂量依赖性诱导，并转化为细胞因子分泌增加。尽管各种代谢途径对ATMS释放细胞因子有贡献，糖酵解主要来自肥胖小鼠ATM产生的较高的细胞因子。肥胖早期ATMS的炎症激活似乎与HIF-1α无关。进一步了解脂肪组织巨噬细胞代谢规划的功能性后果和存在于肥胖脂肪组织的ATMS中的代谢激活，预计将导致新的治疗目标，以减少炎症反应，*终将减少肥胖引起的代谢并发症。

　　方法：小鼠：雄性C57BL／6小鼠饲喂高脂肪饮食（HFD）、低脂饮食。为研究HIF-1α在肥胖动物ATMS中的作用，将9～12周龄的嵌合HIF-1α雄性C57/BL6小鼠置于溶菌酶M驱动的Cre重组酶中或对照组C57/BL6不置于溶菌酶M驱动的Cre重组酶中，暴露于HFD 8周。7周后，通过腹腔注射胰岛素，在禁食5小时的小鼠中进行胰岛素耐受试验。在特定时间点从尾部取血，用ACCU检查血糖仪测量血糖。所有小鼠均单独安置，并随意进食食物和水。所有的饮食都是从研究饮食中获得的。

　　细胞培养：从雄性、野生型C57BL／6小鼠中分离出ATM和腹腔巨噬细胞。进行培养。

　　ATMS：新鲜分离的ATMS培养在RPMI 1640中，培养2h后辅以10%的FCS和1%的青霉素/链霉素24h。通过提供5.5 mmol/L 2-脱氧葡萄糖（2-DG），50μmol/L乙莫克舍，10μmol/L UK5099或10μmol/L BPTES直至培养24h结束时，研究了各种代谢途径对细胞因子释放的贡献。

　　骨髓源性巨噬细胞：在DMEM中培养骨髓细胞，辅以10% FCS和1% PS和5% L929条件培养基。在3～4天后，将贴壁的骨髓来源巨噬细胞（BMDMS）重新贴壁并暴露3天，插入含有25毫克或100毫克的从LFD喂养或HFD喂养的小鼠收集的附睾脂肪组织的插入物。对照BMDMS保存在含有5%（体积/体积）L929的DMEM/FCS/PS中，其空插入物具有相同的时间长度。用10 ng/ml脂多糖（LPS）（M1）或25 ng/ml IL-4（M2）孵育24小时产生M1和M2巨噬细胞。为了测量脂肪组织启动后BMDMs的细胞因子和乳酸的生成，去除了插入物，将BMDMs保存在新鲜的DMEM/FCS/PS中，持续了24小时。

　　脂肪组织：将附睾脂肪组织培养，并暴露在含17.5 nmol／ml胰岛素的DMEM/PS中20分钟，以测量胰岛素敏感性。将组织保存在DMEM/FCS/PS中，用LPS（10 ng/ml）或不用LPS作用24h，测定IL-6释放量。组织在DMEM/FCS/PS中培养3天，用于瘦素和乳酸的测定。

　　细胞外通量分析：使用XF-96细胞外通量分析仪分析ATMS和BMDMs的实时耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）。

　　细胞因子与乳酸测定：用小鼠DuSET-ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中IL-6、趋化因子配体-1（KC）、TNF-α、IL-1β、IL-10和瘦蛋白的水平。用乳酸测定试剂盒测定乳酸水平。

　　免疫组织化学：附睾脂肪组织石蜡包埋切片用F4／80抗体染色，苏木精复染。3，3-二氨基苯使巨噬细胞可视化。

　　微阵列分析与解释：在四个单独的实验中，从LFD或HFD的雄性C57BL／6小鼠的附睾脂肪组织中分离出四个ATMS池，通过微阵列进行表达谱分析。此外，来自不同组织巨噬细胞的原始转录组数据，包括ATMS，从LPS刺激的BMDMs获得。

　　结果：肥胖患者ATMS的独特代谢和炎症激活：为了检查是否存在于脂肪组织中的巨噬细胞与其他组织巨噬细胞的转录不同，我们使用从腹腔、肝脏、脾脏、肺、内脏中分离的巨噬细胞公开的基因表达谱进行主成分分析（PCA）。ATMS展现独特的转录体。肥胖的存在明显地影响ATMS的完整转录组，由肥胖小鼠与瘦肉小鼠分选的ATMS的聚类分析表明，PAN巨噬细胞膜标记EMR1-F4/ 80。传统上，肥胖脂肪组织中的巨噬细胞具有增强炎症状态的特征。使用炎性基因作为PCA的输入，证实存在于肥胖脂肪组织中的巨噬细胞具有独特的炎症激活作用。有趣的是，涉及糖酵解、OXPHOS和氨基酸代谢的基因的表达数据也足以区分肥胖小鼠ATMS与瘦肉小鼠的ATMS，提示肥胖患者ATM能量代谢的强健变化。在肥胖和瘦小鼠ATMS中，许多涉及糖酵解和OXPHOS的基因上调。值得注意的是，肥胖的代谢重排是ATMS特有的，因为在腹腔巨噬细胞中没有观察到这些变化。事实上，ATMS中代谢基因在腹腔巨噬细胞中的表达水平高于腹腔巨噬细胞，并在肥胖中上调。从肥胖与瘦动物衍生的ATMS产生更多的乳酸，反映更高的糖酵解率。相反，在肥胖小鼠和瘦小鼠腹腔巨噬细胞中没有发现乳酸分泌的强健差异。

　　肥胖脂肪组织中巨噬细胞的代谢和炎症激活与LPS的经典激活不同，与肥胖患者2型糖尿病的存在相关：为了进一步了解ATMS中代谢和炎性重新布线的功能特性，用代谢和炎症基因集作为输入进行基因集富集分析（GSEA）。肥胖和瘦小鼠相比，ATMS中的基因集显著多于ATM的耗尽，并且没有耗尽的基因集反映了代谢途径。包括糖酵解和氧磷的代谢基因集在肥胖的ATMS中得到了丰富的富集。ATM在肥胖中的转录调控与LPS的经典巨噬细胞活化非常不同。虽然某些途径受到类似的调控，但大多数代谢途径包括OXPHOS、糖酵解和戊糖磷酸途径，相比于瘦小鼠，LPS激活的巨噬细胞中少或呈负性调节LPS激活的巨噬细胞与肥胖的ATMS相比少或呈负性调节。根据ATMS与经典活化巨噬细胞不同的代谢调控，我们发现肥胖和瘦小鼠ATM中各种促炎性和抗炎性基因，包括CD11c、MyD88、ARG1和IL-10的调控不同，不类似于M1巨噬细胞。

　　ATMS代谢激活在肥胖中的功能性后果: 评估ATMS中的转录改变是否转化为能量代谢的差异。通过测定OCR和ECAR对新鲜分离ATMS的OXPHOS和糖酵解率进行了检测。随着代谢基因表达的增加，肥胖小鼠的ATMS显示出较高的OXPHOS. 肥胖小鼠ATMS中的糖酵解率更高。它证实了在培养24小时后，与瘦小鼠相比，肥胖鼠ATMS上清液中乳酸含量显著升高。肥胖小鼠的ATMS产生更多的IL-6和KC, 胖小鼠的ATMS产生较少的TNF-α,ATMS上清液中IL-1β和IL-10均未检测到。

　　结论：发现ATM在肥胖中具有独特的代谢激活，其特征是增加OXPHOS和糖酵解。阻断ATMS代谢途径导致糖酵解作为促炎特征的主要因素，尤其是肥胖。在肥胖患者的脂肪组织中，从2型糖尿病患者的脂肪组织中观察到的代谢特征与肥胖时ATMS中发现的相似，包括诱导OXPHOS和溶酶体基因。对ATMS代谢的进一步理解将*有可能导致调节巨噬细胞代谢和抑制炎症反应的新治疗靶点，这些炎症反应驱动肥胖患者的胰岛素抵抗和2型糖尿病。