肠道微生物 中国实验动物信息网 2020-11-19 670

　　背景：衰老是一种与炎症密切相关的退化过程。慢性低度炎症典型的衰老，被称为"炎症衰老"，涉及炎症网络激活和释放衰老相关的因素，包括关键促炎介质，如核因子κB（NF-κB）。炎性衰老也可能与年龄相关的氧化/遗传毒性应激和肠道微生物组成变化有关。除了胃肠道疾病、代谢紊乱和抗生素使用外，衰老也显示出影响肠道微生物群的组成；肠道双歧杆菌的含量随着年龄的增长而下降，而产气荚膜梭菌、乳酸杆菌和肠球菌的含量随着年龄的增长而增加。在炎症的背景下是突出的，因为肠道微生物群的组成已被证明与肠道炎症性疾病密切相关。而肠道微生物组分在分子水平上诱导低度炎症的机制尚不清楚。细胞周期调控因子在培养细胞衰老过程中起着重要的作用。在这些分子中，P16*近被挑选出来作为体内衰老的合适标记物。P16通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6的活性诱导衰老，否则会使视网膜母细胞瘤肿瘤抑制因子磷酸化和失活。随着年龄的增加，小鼠骨髓干细胞和祖细胞中p16的表达增加，抑制干细胞增殖和组织再生。无菌α-基序结构域和HD结构域包含蛋白1（SAMHD1），一种与细胞复制相关的细胞脱氧核苷三磷酸水解酶，通过耗尽可用于反转录病毒DNA的细胞脱氧核苷三磷酸池来防止病毒复制。SAMHD1在巨噬细胞和树突状细胞等非分裂细胞中高表达，通过细胞周期蛋白A2/CDK1调节细胞增殖。SAMHD1可通过细胞DNTP的降解调节细胞周期。对SAMHD1在细胞内的功能作用知之甚少。在本研究中，我们首先研究了年轻和老年小鼠中炎性衰老标志物如P16、NF-κB和SAMHD1的组成和LPS产生水平，以及衰老的作用。此外，我们研究了老化和肠道微生物LPS诱导的炎症之间的关系。

　　方法：动物：雄性C57BL/6J小鼠（4月龄或18月龄）和TLR4缺陷C57BL/10SCNJ小鼠（4月龄）。每组由八只小鼠组成。所有小鼠均在20～22°C和50%±10%湿度环境下饲养，麻醉小鼠，采集血液样本进行生化分析。结肠迅速除去，纵向打开，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻地清除粪便，并用于ELISA和免疫印迹。

　　DNA提取、焦磷酸测序及数据分析：使用商业DNA分离试剂盒按照说明提取四组粪便样品中的基因组DNA。使用针对细菌16S rRNA基因的V1至V3区域的条形码引物进行基因组DNA的扩增。按照所描述的方法进行测序和基本分析。每个样品的序列通过独特的条形码进行分类，并去除低质量的读数。以16S rRNA序列数据为基础，利用EZOCTRONE E数据库进行序列读取。序列数目分析，观察多样性丰度（OTU），估计OTU丰富度（ACE和JAU1）。用Mythr程序计算焦磷酸测序覆盖率，并考虑到16S rRNA基因序列的97%相似性的截断值。从每个样本的微生物群落之间的距离表示为未加权成对组方法与算术平均（UPGMA）聚类树描述多个样本之间的相异性。

　　鲎变形细胞裂解试验：血浆和粪内毒素含量测定采用重氮偶联鲎阿米巴裂解液（LAL）测定。简单地将血浆在无热原水中稀释1∶10，在70℃下灭活10分钟，然后在37℃下与LAL孵育30分钟。试剂的加入导致在545 nm处形成吸收光的品红衍生物。对于粪便内毒素检查，来自盲肠的20mg粪便放置在50ml PBS的 无热原管中，并在冰上超声处理1小时。在400 g离心15分钟后，收集上部30毫升，经0.45μm过滤器过滤灭菌，再经0.22μm过滤器再过滤，70℃灭活10分钟。然后用LAL检测试剂盒测定过滤后的超声产物的LPS含量。

　　ELISA和免疫印迹：用ELISA试剂盒测定血浆和结肠中肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素（IL）- 1β和IL-6的浓度。结肠中p16、Bcl-2、ATG7、LC3、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、mTOR、磷酸化p65、p65、SAMHD1、cyclin E、CDK2和β-肌动蛋白的水平用如前所述方法测定。使用ECL检测试剂盒进行免疫检测。

　　腹腔巨噬细胞的分离培养：如前所述，从雄性C57BL/6J小鼠或TLR4缺陷小鼠中分离出腹腔巨噬细胞。小鼠腹腔注射（ip）2毫升4%巯基乙酸酯溶液。注射后4天处死小鼠，用10ml  RPMI1640培养基冲洗腹腔。腹腔灌洗液200 g离心10 min，细胞用RPMI 1640培养基培育。在37°C孵育1 h后，将细胞洗净三次，通过抽吸除去非贴壁细胞。37度，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养腹腔巨噬细胞。为检测小鼠粪便裂解物的炎症作用，腹腔巨噬细胞用100μl粪便裂解物孵育，用于免疫印迹。

　　结果：幼龄和老龄小鼠肠道微生物群落：通过研究不同年龄的小鼠的肠道微生物群来开始我们的研究。从正常（低脂）饮食中维持8周的小鼠收集盲肠样本，用焦磷酸测序法研究肠道微生物群的变化。序列分析的数目、OTU、估计的OTU丰富度（ACE和JAU1）和焦磷酸测序覆盖率是使用具有高同一性的集群数据库来计算的。幼龄小鼠收集的盲肠样本中观察到细菌丰富度和多样性降低，而这些差异在统计学上没有显著性。基于分类学的分析表明，老龄化显著调制了占优势的肠道微生物群。与幼龄鼠相比，老龄鼠的双歧杆菌水平降低，小鼠显示出抗炎作用，乳酸杆菌和肠球菌的水平升高。在本研究中，老龄化增加了厚壁菌和放线菌的患病率，并减少了杆菌的患病率，导致肠菌群中厚壁菌群对拟杆菌比率的全面增加。

　　幼龄和老年小鼠血浆和粪便内毒素水平：TLR4结合的NF-κB信号通路中的CD14等炎性标志物CD14和C反应蛋白随着年龄的增长而增加。先前未考虑的炎症起始来源是肠道微生物群及其产物的易位，导致炎症，如炎症性肠病。为了了解LPS对小鼠衰老的作用，测量了幼龄和老年小鼠的LPS水平。老年小鼠附睾脂肪垫重量/体重比与青年小鼠相比有显著性增加，但体重增加无显著差异。我们评估了在不同治疗组的内毒素水平，以调查肠道微生物组成随年龄的变化是否与全身性内毒素血症相关。老年小鼠粪便内毒素水平高于幼龄小鼠。与幼龄小鼠相比，我们还发现老年小鼠的系统内毒素水平显著升高。

　　P16、细胞周期调控因子和SAMHD1在幼龄和衰老小鼠中的表达水平：P16的表达较高，而老年小鼠的细胞周期素E和CDK2的表达水平则低于幼鼠。我们还观察到，衰老小鼠的NF-κB和mTOR的激活比年轻小鼠更强。有趣的是，随着p16表达的增加，SAMHD1的结肠表达在衰老小鼠中相对于年轻小鼠增加。

　　LFL增加巨噬细胞SAMHD1表达和炎症反应：衰老小鼠的LFS在不同浓度LPS处理的腹腔巨噬细胞中诱导WT小鼠腹腔巨噬细胞中P16和SAMHD1的表达显著高于幼龄小鼠。

　　结论：这些结果表明，老龄化可通过增加肠道微生物群LPS水平，通过诱导小鼠P16和SAMHD1表达和NF-κB活化来加速炎性衰老。在本研究中，我们证明了SAMHD1在炎性衰老或炎性老化条件下的表达增加，提示SAMHD1可作为小鼠炎症衰老的新标志物。