吸入麻醉方法 中国实验动物信息网 2020-10-27 712

　　简介：理解大脑功能的机制需要揭示神经元网络的结构、连接和活动。重组DNA技术已使强大的遗传编码工具得以开发，这些工具可用于细胞群体的可视化，基因组DNA的编辑以及神经元回路的追踪。这些工具可以通过脑内立体定向注射，以重组病毒的形式进入成年啮齿动物的特定脑区。这项广泛应用的技术包括在注射前通过外科手术打开颅骨，每只动物大约需要40分钟，但效率很高，为成年动物提供可靠的神经传导。利用新生啮齿类动物进行的研究虽然不那么普遍，但同样有价值，可以分析发育过程、长期转基因表达以及利用年轻组织进行敏感的电生理实验。然而，由于缺乏新生儿使用的实验设备而变得复杂，而且关键是这些动物的麻醉困难。众所周知，新生儿麻醉是不可靠和不可控制的，给其使用带来了巨大的福利挑战。使用低温进行麻醉，在冰上孵育幼崽约15 min，但低温麻醉的深度未知且难以控制。目前尚不清楚低温是否会产生麻醉或只是简单地固定化，并且已经表明从低温中恢复会带来痛苦和损害。因此，根据3Rs原则，此方法现在受到限制。在P0-2处进行新生小鼠吸入麻醉的程序。使用3D打印设备进行麻醉递送，我们详细介绍了使用异氟烷进行可控维持和从吸入麻醉中可靠恢复的方案。这种方法可以很容易地被任何实验室应用，并为新生啮齿动物的福利提供了重要的改善，促进了它们在一系列科学学科中的应用。利用这种方法，我们在P0−2小鼠的脑内进行腺相关病毒（AAV）的脑内注射。可以在不到2小时的时间内安全可靠地注射一窝完整的产后动物，从而为脑区域特异性转导提供了一种快速有效的手段。

　　立体定向注射程序：使用小型动物立体定向框架进行注射，并使用汉密尔顿注射器通过显微注射适配器进行病毒递送。建议使用粗调手柄，以方便病毒输送。 麻醉模具位于框架下方，使用塑料盒可达到所需的高度。

　　注射器准备：使用移液器上的一步加热方案将硼硅酸盐玻璃毛细管拉入锥形玻璃针中。 使用直径为∼50至80 μm的镊子打碎玻璃，形成斜面尖端。每个移液管的针尖尺寸在放大镜下确认（例如使用微透镜）。排除注射器中的空气，以确保准确的体积分配； 因此，注射器完全充满了矿物油。 使用Luer注射器和30 G针头回填针头，并使用玻璃移液器适配器将其固定在Hamilton注射器中，并放置在框架上。AAV通过针尖装入玻璃针，以尽量减少浪费的病毒量。将一滴含PBS的AAV滴在针尖下方的副膜上，使用立体定向框架将Hamilton注射器柱塞缩回，以将所需体积吸入针头。AAV的体积不应超过玻璃吸管的体积，以防止实验之间的交叉污染。注射3只动物后要更换玻璃针，以防止堵塞或钝化。 每只动物后更换针头需要大量的准备时间，延长手术时间，并有母鼠排斥的危险，因此不建议使用。

　　麻醉诱导：即将开始操作之前，将整个巢（包括幼崽和垫料）从母笼移到一个空笼中。麻醉诱导在一个小的诱导室中进行，氧气-4%异氟醚的流量为2 L/min，持续3-4.5 min。3分钟后，以30秒的间隔用镊子轻轻捏脚，以测试麻醉状态。然后将新生儿转移到麻醉模具中，4%异氟醚，流速2 L/min，用组织覆盖物和微孔胶带固定。为了尽量减少实验者对异氟醚和动物过敏原的接触，建议在下吸式工作台上进行操作。

　　脑内注射：相对于lambda测量特定大脑区域的注射位置。在LED照明下，移液管位于注射部位上方，深度轴（z）在皮肤高度归零。通过快速而牢固地放下玻璃针以穿透皮肤和颅骨来进行注射。穿透后，将注射深度调整到所需位置，手动控制缓慢注射入病毒。我们使用0.5μL的病毒注射量，每个半球大约1×1012 GC ml-1。 将玻璃移液器从颅骨上轻轻收回，如果需要，在第二个半球重复注射。

　　恢复：麻醉的总持续时间约为6–10分钟 。注射后，动物的尾巴用笔标记以区别于未注射的动物，并与剩余的产仔一起返回巢中，以便从麻醉中恢复。随后的动物按照同样的程序注射。一旦完成所有注射，检查幼崽是否成功恢复（通常为10-20 min），通过自发肢体活动确定。动物成功恢复后，将其放回母笼。 从设置到恢复，一窝6-8只幼崽的注射通常大约需要1.5-2小时。

　　结果：新生儿吸入麻醉诱导：我们旨在开发一种强大而可靠的技术来麻醉新生小鼠，以替代低温疗法。 我们在诱导室中使用4％异氟烷监测了P0-2小鼠的麻醉诱导，这通常用于成年小鼠的麻醉。至少需要3 min的异氟醚暴露才能获得可靠和足够的麻醉深度，这明显麻醉时间比成年小鼠更长。但是，必须用温和的夹脚确认每只动物的持续时间，因为即使没有完全麻醉诱导，新生小鼠的运动水平也可能很低。我们已经注意到，麻醉时间的延长可能与不可恢复相关，但是出于伦理学原因，尚未对此进行实验性检查。我们诱导幼崽的时间不超过4.5 min，如果对捏脚的反应仍然明显，则该动物将不接受该程序。使用3分钟到4.5分钟的诱导，训练有素的使用者可以预期*小的不恢复发生率。

　　使用定制框架维持麻醉：我们设计并制作了一个三维打印气体流动装置，包括一个新生儿形状的模具和一个由同心环构成的鼻锥，用于麻醉输送。流入（中央）和流出（外部）路径通过嵌入框架的金属适配器连接到标准麻醉设备。

　　新生小鼠年龄的考虑：为了限制注射的幼崽的流失，尤其是由于母鼠的同类相食，我们和其他人以P1而非P0进行注射，因为可以避免出生后24小时内的婴儿死亡率。对于成年动物来说，进入大脑需要在颅骨上钻孔，而在P0−2处，可以用玻璃注射针穿透软颅骨。这大大简化了程序，大大缩短了试验持续时间，并允许在1.5-2小时内注射一窝完整的幼崽（6-8只幼崽），从设置到恢复大约需要1.5-2小时。由于颅骨发育增厚，这种方法只能用于P3以下的动物。

　　脑内注射进行神经元标记：我们用两种实验方法来演示这个过程。 首先，我们将表达Cre依赖性tdTomato（lox-Stop-lox盒）和Cre-EGFP的AAVs以10000:1的比例共同注入两个离散的脑区，用于神经元群体的稀疏荧光标记。向每个半球海马或额叶皮质注射0.5μl病毒混合物，总浓度为1.5 × 1012 GCml−1。在P8脑解剖时，相应的脑区有明显的强阳性表达。

　　脑内注射用于器官型组织制备：海马器官型切片培养是一种强大的方法，可以对神经元生理进行离体分析，但需要在P7左右收集组织。新生儿注射可在收获前进行体内组织转导，增加实验时间的灵活性。这对于诸如Cre依赖的基因切除等基因组操作尤其重要，这可能需要数周时间才能去除高度丰富或稳定的靶蛋白。

　　我们已经证明了新生儿脑内注射在器官型培养前进行体内组织转导的价值，并在突触受体研究中采用了这种方法。我们的技术提供了一种快速有效的神经元转导方案，并且已发布的新生儿脑图将有助于对任何脑区域的立体定向。这项技术可能为发展神经科学研究（如子宫内电穿孔）提供了一种替代方法，对小鼠福利具有实质性好处。我们所报告的方案和装置极大地提高了啮齿动物的福利，并且可以轻松地进行调整，以便在神经科学和更广泛的科学研究中更多地使用新生动物。