腮腺细胞 中国实验动物信息网 2020-10-15 373

　　1、实验方法：4个月大的实验小型猪，常规麻醉在无菌条件下，提取腮腺肺泡组织，去除腺小叶包膜和其他结合组织，然后浸入HamF12培养基（含100 U/ml青霉素，0.1 mg/ml链霉素）中。对于小于1 mm3的小块，用不含Ca2 +的Mg2 + Hank平衡盐溶液洗涤两次，并在37°C下用含有2.5 mg/ml混合胶原酶的HamF12培养液消化1小时。过滤并在室温下放置10分钟，以容纳含有50 ml/L热灭活胎牛血清，10μg/ ml还原型谷胱甘肽，1 mmol/L腐胺，5μg/ ml转移酶，5μg/ ml胰岛素的细胞。收藏，在HamF12完全培养基中添加10g/ml表皮生长因子地塞米松。将分离和消化的细胞以104细胞/ ml的浓度接种在覆盖有Matrigel的24孔Falcon培养板上。倒置显微镜，电子显微镜，角蛋白抗体，α-淀粉酶抗体免疫组织化学染色观察细胞。

　　2、通过相差显微镜观察获得的实验结果：接种分离的腮腺细胞后数小时，单个细胞聚集，并且在36小时内，细胞附着到培养底物表面，此后单个细胞可以看到它从细胞团的边缘开始延伸，大多数细胞在大约3天之内见到，它以单层生长并附着在壁上。像元大小相对均匀，大多数看起来是圆形的并且紧密对齐。在第5天，可以看到细胞生长并成片状连接，细胞的中央部分活跃地增殖，有些细胞是多边形的长梭形。在这些条件下，细胞可以存活近3周。 HE染色显示细胞单层生长，大多数为圆形或圆形，有些细胞为长纺锤体。所有细胞核均染色并居中。免疫组织化学染色结果显示，培养的细胞角蛋白单克隆抗体染色为阳性，α-淀粉酶多克隆抗体染色为阳性，波形蛋白单克隆抗体染色为阴性。纤维细胞角蛋白单克隆抗体的对照组成和α-淀粉酶多克隆抗体染色为阴性，波形蛋白单克隆抗体染色为阳性。渗透电子显微镜观察：培养的细胞在细胞核中呈圆形，居中或偏移，中等发育的细胞质线粒体和粗小囊泡，小的Gorgi装置以及许多具有不同电子密度的分泌颗粒。包括。 ，每个分泌的颗粒都被完整的单位膜包围，颗粒内的密度不均匀，并且包含大量细颗粒。细胞膜表面有不同密度的稀疏微绒毛。一些细胞在其细胞质中包含微丝，并且不包含分泌性颗粒。

　　（1）蛋白质分泌的测定：将细胞在24孔板中培养24小时后，测定的吸收值为1.58±0.49，蛋白质含量为（3±0.93）mg/ml。

　　（2）α-淀粉酶的测定：结果显示，培养第二天，培养液中α-淀粉酶的含量*高（343U）。随着体外培养时间的增加，α-淀粉酶含量显着下降。培养4天后，刺激组培养液中的淀粉酶含量明显高于未刺激组（P\u003c0.05）。在培养的第5至第6天，培养液中的α-淀粉酶含量降至初始值的30％，并且在培养的第10天，培养液中的α-淀粉酶含量降至低于初始值8％。

　　（3）异丙肾上腺素的作用：腮腺细胞在体外的长期存活取决于向培养基中添加分泌物。新分离的腺泡细胞在形态上与体内细胞相似。不含异丙基时。在肾上腺素培养基中培养2天后，细胞收缩，一周内细胞边界模糊并死亡。分泌性异丙肾上腺素的添加可以防止上述变化。添加异丙肾上腺素组和未给予异丙肾上腺素组的腮腺细胞均表达α-淀粉酶，但表达水平不同，前者的表达增强。

　　（4）不同浓度的血清对细胞增殖的影响：当将50 ml/L的牛胎血清添加到HamF12完全培养基中时，腮腺细胞会更快地附着在壁上并增殖良好。加入100 ml/L的牛胎血清后，成纤维细胞旺盛生长，上皮细胞几乎不生长。所有细胞无血清生长缓慢。