基因型鉴定 中国实验动物信息网 2020-10-14 889

　　基因型（遗传类型）是指与生物体DNA中包含的性状相关的基因类型。转基因动物的基因型主要通过PCR和Southern印迹分析来鉴定。 PCR反应是一种传统方法，对于转基因动物可能需要进行Southern杂交以检查导入基因的拷贝数。

　　Southern杂交也可用于确定导入的基因是否已重排或缺失。当基因重排时，限制性位点改变，导致不同的限制性模式。实时PCR（RT-PCR）可以快速确定转基因mRNA的表达。转基因被随机插入动物的基因组中。如果转基因动物是正常的，通常不需要定位转基因整合体。

　　为了鉴定，可以在显微镜下通过荧光原位杂交（FISH）直接观察整合的位置和局部染色体结构。该技术还可用于检测转基因插入位点的染色体重排和由Cre重组酶诱导的局部染色体缺失。 PCR反应基因分型的原理是首先设计一种特异性引物，该引物可以与引入的外源基因结合并扩增动物基因组中不存在的DNA序列。底漆设计非常重要。通常在转基因中发现用于转基因动物基因分型的引物。通常，选择特定的DNA序列作为引物以确定是否存在转基因。在大多数情况下，转基因的插入位点是未知的，并且难以设计引物来确定转基因是纯合的还是杂合的。对于基因敲除和基因敲入动物，基因修饰的位置是众所周知的，因此可以设计野生引物和突变引物来确定基因型是纯合的还是杂合的。突变引物对：一种引物在同源重组短臂的外部，另一种引物在引入的外源基因（例如Neo基因）的内部。通常在敲除的DNA序列中发现野生引物。突变和野生PCR产物的大小应在100-700 bp之间变化。这对于通过凝胶电泳进行鉴定和鉴定就足够了。引物的GC比率约为50％（40％-60％）。

　　分析基因型时，请注意对照组的设置。 PCR反应的阳性对照：可选的内源管家基因，例如β-肌动蛋白，以确定DNA质量和正确的扩增反应体系。每个DNA样品的PCR反应必须为阳性。阴性对照：通常用水代替DNA模板以消除污染和假阳性的对照组。实验过程：提取转基因动物的DNA，通过PCR反应和琼脂糖凝胶电泳扩增靶序列，并检测DNA片段的存在和大小以确定基因型。为了从活组织中分离基因组DNA，小鼠的生物解剖组织可以是一条尾巴或耳朵组织。转基因小鼠的基因分型只能用特定的一对引物进行分析，结果是阳性（+）或阴性（-）。正意味着有一个导入的基因，而负意味着没有一个导入的基因。敲除或敲入小鼠基因型的鉴定通常需要设计两对引物。一对引物扩增野生形式，另一对引物扩增变异体。基因型鉴定结果分为三种。野生型用+表示，变体类型用-表示。 +/-是敲除杂合子，+/+是野生小鼠，-/-是敲除纯合子。

　　基因表达水平的鉴定：转基因动物模型。多种方法（PCR，蛋白质印迹，流式细胞仪等）可用于确定转基因转录或蛋白质表达水平。在基因敲除或敲入模型中，有必要观察目标基因是否被敲除以及该基因是否表达。转录水平分析可通过Northern印迹，核糖核酸酶（RNase）保护分析和非定量RT-PCR来实现。如果需要定量，可以通过RT-PCR进行测定。该方法易于使用，定量精度高，是基因表达分析的常用方法。原位杂交技术也可用于确定组织和细胞中的mRNA表达水平。*后，鉴定应包括对蛋白质产物及其表达水平的分析。这与任何动物模型显示的表型有关。大多数蛋白质分析方法要求使用针对基因产物的特异性抗体。这些技术包括蛋白质印迹，酶结合免疫吸附测定（EUSA），放射免疫测定（RIA）和免疫组化染色。