DNA显微注射法 中国实验动物信息网 2020-10-14 5686

　　DNA显微注射法是*早，*成熟且使用*广泛的转基因技术。其他方法是对该方法的改进和补充。借助微操纵系统，将外源基因直接注射到供体动物的受精卵中，因此外源DNA整合到基因组中以产生转基因动物。下面主要介绍受精卵的前核显微注射方法。 DNA显微注射方法的基本过程包括转基因载体的制备，胚胎操作和显微注射以及转基因动物的鉴定和培养。

　　显微操作需要关键设备，例如倒置显微镜，显微操作系统，显微注射系统，立体镜，针头锻造仪器和显微外科手术仪器。倒置显微镜必须配备DIC功能。常用品牌是蔡司和尼康。微分干涉对比显微镜（DIC）的优势在于，它可以显示三维结构，并有助于将DNA直接注入细胞核。显微操纵系统主要包括3D电粗显微操纵器，3D液压显微操纵器，持针器，持针器支架和显微镜支架。主要品牌是Eppendorff和Narisige。 Eppendorff显微镜操作系统由TransferManNK2、CellTramvario（用于转移和输注），CellTramAir（用于固定受精卵）或CellTramOil（用于固定胚胎）组成。微注射装置使用FemtoJet /FemtotipⅡ，可以去除少量（约1至2 pl）。将受精卵的DNA，RNA和蛋白质注入雄性细胞核。显微注射系统的辅助设备包括激光破裂系统或压电机械穿孔，适用于使各种物种的胚胎中的带状疱疹变薄，并且可以显着提高ES细胞输注的成功率。我可以。在立体镜下操作以获取并冲洗胚胎。

　　1、转基因载体的制备构建转基因载体后，必须用限制酶消化该载体，并通过琼脂糖凝胶电泳以适当的浓度分离转基因片段。 DNA凝胶回收试剂盒用于从凝胶中回收DNA片段并测量DNA浓度。注射的DNA浓度通常很低，通常为2-3g /μl。

　　2、胚胎操作和显微注射DNA显微注射通常需要注射大量含有激素（怀孕的马血清PMSG和人绒毛膜促性腺激素，hCG）的卵母细胞，以刺激排卵。有。在特定的时间点，将4-6周龄的供体母鼠（FVB/DBAF1或C57BL/6）注入激素（PMSG/hCG）。显微注射前一天，将供体雌性小鼠和雄性小鼠交配以获得受精卵，并且还需要胚胎受体小鼠。 DNA微量注射的前一天，将C57BL/6只雌性小鼠和结扎的雄性小鼠交配。第二天早晨，检查小鼠，并且带阴道塞的雌性小鼠是假孕小鼠。在注射当天，解剖过度排卵的雌性小鼠，切开卵巢和Faropius管，并收集受精卵。用透明质酸酶消化珍珠岩，并将卵细胞置于一滴胚胎培养基中。调整微操纵器和针头以将DNA溶液移至微操纵器。显微注射的基本原理是，用光滑表面的玻璃移液管从显微镜上吸出受精卵，并用另一个非常细的玻璃针将DNA溶液吸到受精卵的雄性原核中。是直接注入。注入的受精卵被转移到受体动物的输卵管中，并成长为后代。显微注射的优点是简单，快速和快速，这是现在的经典方法。

　　针太细，以至于限制了您注射的DNA的大小。 DNA片段越长，制备转基因动物就越困难。*常用的是质粒DNA，大小约为10 kb。超过50 kb的DNA难以显微注射，超过400-500 kb的DNA难以显微注射以获得完整的转基因。

　　BACDNA微量注射：BAC是一种环状DNA，可以用DNA提取试剂盒（例如QIAGEN）进行分离。用适当的缓冲液重悬和保护BAC DNA样品会增加BAC序列完全转移到基因组的可能性。 PFGE用于测试纯化的BAC DNA的分子完整性。显微注射法通常用于将BACDNA直接注射到受精卵的原核中。用于显微注射的BACDNA的有效浓度范围很小，通常为0.5g /μl。如有必要，可以降低浓度以增加受精卵的存活率并提高出生率。由于BAC DNA较大，注射过程中产生的剪切力会破坏DNA。需要通过PCR和Southern Brotting鉴定所得的转基因小鼠，以确定它们是否包含完整的BAC导入基因。

　　通常将注入的DNA整合到簇中的单个位点中，拷贝数从几到数百不等。插入了多个拷贝的DNA后，可用于筛选具有高表达外源基因的转基因动物。正常的转基因动物使用质粒作为载体，但是缺点是克隆质粒DNA的能力太小，无法克隆表达控制元件，例如大基因和位点控制元件。这些转基因动物应被称为“ hemidigas”，而不是“杂合子”，因为它们在对应于整合位点的同源染色体上没有对应的同种异体。转基因整合的数量，即转基因拷贝的数量，通常与DNA片段的大小成反比。因此，DNA片段越大，成功整合的难度就越大。由于转基因在原核注射中的随机整合，转基因表达通常受到插入位点周围基因的影响。由于不同的整合位点，每个转基因动物表现出不同水平的转基因表达。这些作用可导致基因沉默，改变转基因在细胞和组织中的特异性表达或影响整体表达水平。当将转基因掺入常染色质区域时，周围内源性增强子的作用增强了转基因表达。当将转基因掺入异染色质区域时，发生异染色质介导的沉默并且表达水平降低。 ..研究表明，整合位点可以巧妙地影响大脑中转基因的表达。当转基因插入内源基因位点时，它可以改变内源基因在整合位点的表达或使插入失活。实际上，可以通过分析多只成年小鼠来推断插入位点的作用。插入位点的作用也可以通过在转基因片段中添加一个绝缘子序列来降低。