点特异性重组系统 中国实验动物信息网 2020-10-14 476

　　“点特异性重组系统”包括Cre-LoxP系统和FLP-FRT系统，迄今为止，使用*广泛的方法是Cre/LoxP介导的点特异性重组系统。

　　Cre-LoxP系统*常用于条件基因敲除，也用于体内转基因的条件表达，包括某些类型的细胞和某些发育中的组织。转基因的表达可以在特定的时间和空间实现。表达为过程或成年。在1980年代发现的Cre/LoxP点特异性重组已成功地用于酵母，植物，培养的哺乳动物细胞和小鼠中。 Cre（引起重组）是一种从噬菌体P1分离的38 kDa重组酶，可识别LoxP位点。 LoxP位点是有方向性的，因为LoxP [位于P1上的交叉点（x）]元素是一个34bp长的序列，由两端均为13bp的回肠虫序列和中心为8bp的不对称序列组成。 Cre重组酶可以介导两个LoxP元件之间的重组反应，每个重复序列都可以与Cre分子结合，并且重组发生在间隔区。两个LoxP元件可以放置在相同或不同的DNA链上。如果同一条DNA链上的两个LoxP元素具有相同的方向，则Cre酶会介导LoxP之间DNA序列的切除和环化，而在原始序列中仅保留一个LoxP元素，而在另一个LoxP中保留一个LoxP元素。该位点序列通过重组进入环。

　　环化的DNA序列缺少DNA复制序列和着丝粒，并且随着细胞分裂而丢失。当两个元件的方向不同时，Cre酶介导LoxP元件之间DNA序列的恢复，从而导致方向改变。当两个LoxP元件位于不同的DNA链上时，Cre酶介导链之间的重组或不同DNA链之间的转移，交换大片段。通过Cre酶的重组反应也是双向的。例如，切下的环状DNA也可以重组回DNA链，但是出于动力学原因，Cre酶重组倾向于被切下而不是插入。 Cre-LoxP可用于控制转基因的表达。首先，在启动子和受控转基因前后插入一个带有两个LoxP位点的终止序列（LoxP-Stop-LoxP）（终止序列或Stop box）。终止盒翻译末端表达序列阻止转基因的表达。具有Cre酶活性，LoxP之间的终止表达序列被删除，使转基因得以翻译和表达，从而打开了沉默的转基因。使用细胞类型特异性启动子控制Cre表达可以在特定发育阶段或特定生理条件下激活Cre重组酶。已经构造了许多组织特异性的Cre小鼠，可以在Cre小鼠库中找到它们。例如，在神经系统中，在神经上皮细胞（包括神经胶质细胞）和神经祖细胞中表达的巢蛋白基因（nesin）被广泛用于在整个神经系统中产生敲除小鼠。estin基因的第二个内含子具有两个增强子，即大脑特异性增强子和泛中枢神经系统增强子，它们可以在中枢神经细胞中特异性表达Cre。

　　Carmodulin激酶二钙启动子通常用于在大脑神经元（包括大脑皮层和海马体）中表达Cre，并导致大脑中的基因失活。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有类似的点特异性重组系统Flp/FRT，用于产生诱导型转基因模型。 Flp Flipper识别34bp的flippase识别目标序列（flipperse识别目标，FRT）。 Flp和Cre可以结合使用。例如，Flp/FRT用于去除ES细胞阶段的选择性标记基因，而Cre用于体内产生基因敲除。  Cre-ER系统：雌激素受体（ER）的变异体已经失去了与内源性雌激素结合的能力，但仍然可以与雌激素拮抗剂他莫昔芬结合。 Cre和雌激素受体突变基因的融合构成ER-Cre融合蛋白；无需诱导，融合蛋白Cre在细胞质中解离，并与非活性热激蛋白（hsp90）形成复合物。我会。配体他莫昔芬的结合破坏了ER-Cre与hsp90之间的相互作用，将Cre转运到细胞核，并用两侧LoxP位点切除了靶DNA靶序列。 tamoxyphene系统因其严格的基因调控而闻名，但基因切除并非在所有组织和器官中都有效。 Cre重组酶介导的基因调控在小鼠基因调控中诱导基因表达，是一个非常敏感的系统。但是，Cre重组酶介导的基因切除是一次性且不可逆的。

　　工具口：使用不同的通用或组织特异性启动子和不同的诱导型基因表达系统（Cre-LoxP或Tet-On/Tet-Off）等关键研究蛋白，例如EGFP，Cre/FLP重组酶已在小鼠中建立了许多重要的转基因工具。杰克逊研究所和其他机构已经收集了这些小鼠，并为EGFP，Cre，荧光素和Tet工具建立了小鼠库。