如何制备哮喘大鼠模型和如何分离T淋巴细胞？

哮喘大鼠模型,分离T淋巴细胞

中国实验动物信息网

2020-10-14

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　　大鼠哮喘模型的分组和建立实验大鼠分组：根据随机原则，对24只雄性Wistar大鼠（体重190-250 g）按照体重进行编号，并采用随机列表法。我使用它并将其分为以下四个组。

　　（1）正常对照组

　　（2）哮喘1周组（兴奋1周）

　　（3）哮喘2周组（兴奋2周）

　　（4）哮喘4周组（兴奋4周或更长时间）。

　　建立哮喘模型：在*天，将三毫升哮喘组的每只大鼠大腿内侧皮下注射OVA悬浮液1 ml（OVA 10 mg +氢氧化铝200 mg + 0.9％1％的正常生理盐水）。同时，腹膜内注射使百日咳灭活，使用芽孢杆菌悬浮液1ml（约6 * 109株）作为佐剂，第8天重复致敏，第15天致敏。放在自制的玻璃容器中，隔天使用402超声波雾化器（上海四林医疗设备厂），每周50次，每次50分钟，注入50 ml 2％OVA中等雾度的悬浮液。分组刺激1周，2周和4周或更长时间。刺激OVA悬液后，大鼠表现出刺激，咳嗽，呼吸急促，运动缓慢或倾向等症状，肺的组织病理学切片显示嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润。小气道和小血管的收缩引发哮喘。成功。向正常对照组腹膜内注射等量的1ml PBS代替OVA悬浮液，在2周后喷雾，并每天一次用50ml PBS溶液的中雾吸入30分钟，持续15天。 .. T淋巴细胞的分离和体外培养无菌地穿刺亚颗粒静脉，从每组大鼠中收集10ml血液，分成离心管，并用等量的PBS稀释。，慢慢加入等量的淋巴细胞。在分离液上形成层状界面。

　　以2200pm离心20分钟以查看分层的界面。在离心管中间吸出一层乳白色液体，加入0.85％的氯化铵破坏红细胞，在室温下放置2分钟，然后停止与PBS的反应。在室温下以1800pm离心10分钟以除去上清液。

　　继续用PBS稀释剂洗涤两次，并以1600pm的速度离心15分钟。

　　除去上清液，并使用含10％牛胎儿血清的RPMI-1640培养基将沉淀物调节至1 ml，并用移液器轻轻混合。将细胞悬液在37°C，5％CO2的培养箱中放置1小时；

　　将细胞悬液在无菌尼龙棉柱中，在37°C，5％CO2的培养箱中孵育1小时，以分离T细胞。并用≥90％的tripan blue测试活细胞；

　　在24孔培养板上使用含10％FBS和1的RPMI-1640培养基将T细胞浓度调节至2 * 106/ml在37°C的培养箱中每孔注入1 ml 5％的CO2、在文化中。