转基因小鼠F0 中国实验动物信息网 2020-10-14 799

　　1.用于显微注射原核生物的DNA的制备：通常通过电泳，凝胶回收，沉淀和纯化进行线性化和纯化。工作浓度通常为1-5g /μl。应当小心，因为此处DNA的纯度和浓度将对随后的成功率产生重大影响。

　　2.同时获得供体雌性小鼠（由注射激素的雌性小鼠和正常雄性小鼠交配产生）和假孕受体雌性小鼠（由正常雌性小鼠和结扎的雄性小鼠交配产生）。供体小鼠用于收集注射用的受精卵，假孕雌性小鼠用于在注射后存活的受精卵，*后产生了F0代转基因小鼠。

　　3.将绒毛的促性腺激素注射入供体小鼠后，收集具有清晰核的原核受精卵。绒毛促性腺激素可使雌性小鼠排卵的次数是正常排卵次数的两倍。显微注射的受精卵*好在交配后的早晨，注射前数小时收集。此时，注射操作很容易。

　　4.使用显微注射，将纯化的外源基因注射到受精卵的原核中。工作液中的受精卵会形成团块，用于显微注射的受精卵必须是没有细胞碎片的单细胞。如果不符合此标准，则必须用透明质酸酶消化，然后冲洗。

　　5.鉴定受精卵，存活的受精卵或存活的胚胎，并转移至同步交配的假怀孕雌性小鼠的法罗比乌斯管（或子宫）中，无论它们是否怀孕，以及单独的繁殖后确定发展状态。

　　6.在后代小鼠中检测外源基因整合和表达。在产生的幼犬中有转基因小鼠，约占所有小鼠的20％至30％。因此，需要鉴定和筛选转基因小鼠。鉴定基因是否整合的*常用方法是PCR和Southern杂交。orthern杂交，RT-PCR检测，Western杂交和免疫组织化学用于检测转移基因的蛋白质表达状态。

　　7.建立转基因小鼠品系。

　　在上面的部分中，除了显微注射外，我们还设计了许多精密的操作，例如结扎雄性小鼠，从母亲体内分离受精卵，以及进行动物实验，例如移植受精卵。该过程繁琐，准备实验非常仔细，并且还需要了解动物生理学，解剖学和分子生物学的原理和操作。在短时间内难以建立稳定高效的平台。