CRISPR,基因组编辑系统 中国实验动物信息网 2020-09-22 503

　　为了敲除斑马鱼胚胎中的基因，哈佛大学的发育生物学家Alexander Schier使用了基因组编辑系统CRISPR。然而，席尔*终淘汰了一个或多个基因。他和他的同事们设计了一种标记和跟踪发育中的动物细胞的新方法。研究结果在线发表在《科学》杂志第26期上。研究人员利用CRISPR诱导的突变揭示了一个令人惊讶的发现：成年斑马鱼的许多组织和器官仅由一小部分胚胎细胞形成。

　　一些研究人员已经开始使用这种方法来研究开发过程。伦敦Kerrick研究所的发育生物学家James Brisco将该方法称为“ CRISPR技术的创新应用”。 “这项技术有助于重建构成动物身体的所有细胞的“血统”。 “一些科学家计划使用这种方法来追踪肿瘤的进展。一些人使用CRISPR来记录细胞历史，包括细胞对环境的影响。

　　GESTALT的新技术：建立动物体内所有细胞的“家族图”

　　Sheer和她的同事来自哈佛大学遗传学家乔治·丘奇（George Church）。我们使用了CRISPR的“基因组破坏”功能。在正常的CRISPR编辑中，一种称为引导RNA的分子可将Cas9酶准确地引导至基因组中的特定位点，在该位点切割双链DNA。模板DNA可以诱导细胞修复双链断裂，编辑准确性可以达到单碱基改变的水平。但是，如果科学家不提供模板链，则细胞将无法准确修复断裂，*终基因将形成“疤痕”，从而可能发生核苷酸丢失或插入。为了确保真正剔除

　　目标斑马鱼基因，Schier引入了几种靶向该基因多个位点的不同指导RNA。但是，一些重复实验的结果却大不相同。去除的大小是不同的，遗传疤痕区域出现大小插入。华盛顿大学的遗传学家Shear和Jay Shendua意识到，这种遗传破坏的多样性可以得到进一步利用。 Schier和Shendure已将一系列外源DNA插入斑马鱼胚胎的基因组中。接下来，将对应于靶序列的Cas9酶和10个指导RNA注射到单细胞胚胎中。当胚胎发育时，每个细胞的CRISPR系统会破坏目标DNA多次，并用条形码标记（唯一删除或插入）。当细胞分裂时，子细胞首先带有相同的条形码标签，并在不同位置被Cas9切割后经历不同的变化。条形码的*次更改发生在2单元阶段。约4个小时后，编辑工具会慢慢关闭。此时，胚胎包含数千个细胞。然后遵循其余的条形码。这些细胞的持续增殖发生在成年动物中。

　　四个月后，科学家收集了成年斑马鱼器官，并从大约200,000个细胞中分离出1,000多种不同的条形码。由于具有相似条形码的细胞更可能在以后的发育中分裂和形成，因此科学家可以使用计算机程序来计算这200,000个细胞的谱系。换句话说，您可以使用系统发育图找出每个细胞的来源。

　　*令人惊奇的发现之一是，所有器官中的许多组织都是由少量细胞产生的。在大多数器官中，超过一半的细胞共享少于七个条形码。在除大脑以外的所有器官中，25种不同的条形码构成了90％以上的细胞。布里斯科说：“组成组织的细胞数量可能比预期的要少。”对于

　　发育生物学家来说，这项称为GESTALT（用于谱系追踪的合成靶点阵列的基因组编辑）的新技术有助于了解动物是如何由单个细胞形成的。的。它还有助于阐明癌症研究中的重要问题，例如肿瘤中前体细胞的数量，肿瘤内细胞之间的关系以及癌细胞扩散与原始肿瘤之间的关系。

　　Schier说，这项技术也有一些缺点。例如，并非所有新一代细胞都可以可靠地标记。但是，与跟踪细胞及其后代的其他方法（例如，依靠染色方法或自发突变）相比，使用CRSIPR生成的条形码标记进行后续分析更为有效且易于使用。我会。波士顿儿童医院干细胞项目负责人伦纳森说： “用这种方法标记细胞的方法比现有方法更容易，因此癌症生物学家将考虑使用这种方法来研究癌症。尝试一下。

　　另一个mSCRIBE系统：记录细胞所经历的环境影响

　　研究人员正在提出其他方法将CRISPR转变为一种细胞记忆。她说：“从概念上讲，这是*令人兴奋的事情。历史可以记录在DNA中。”麻省理工学院的研究小组已经在进行这项研究。上周，Timothy Lu和他的同事在预打印的网站bioRxiv.org上上传了一篇文章，描述了一种称为mSCRIBE（哺乳动物合成细胞记录仪集成生物学事件）的系统。研究人员没有添加包含10个CRSIPR靶向序列的条形码，而是修改了该位点，以将单个CRISPR靶向序列插入细胞并编码指导RNA。*终，系统以自身为目标。指导RNA诱导Cas9进入其源DNA，从而破坏DNA并导致序列突变，*终产生包含突变的指导RNA。突变的引导RNA进一步将Cas9引导至修饰的靶序列，并且该过程继续循环。在此期间，DNA序列和指导RNA也不断变化。通过研究CRISPR靶序列在数千个单细胞中的变化，研究人员估计Cas9需要执行几轮才能生成特定序列。 （此过程类似于交流游戏中需要的回合数。）将*个短语“龙虾煮”转换为“输队”。在下一个实验中，我们将Cas9靶基因的活性与细胞内炎症途径的活性相结合。在暴露于更多炎症因子TNFα的细胞中，在目标序列中记录了更多轮的Cas9突变。接下来，用CRISPR记录工具测试小鼠，给动物注射修饰的细胞，并向某些细胞注射促炎分子。与未治疗的小鼠相比，在注射了这些分子的小鼠中，CRIPR靶向序列发生了改变。作者写道，该方法可以应用于体内，以模拟方式记录生理相关的生物特征信号。 Lu和他的同事建议，这种方法可以在肿瘤微环境中记录癌细胞刺激物，并在疾病发展过程中追踪细胞内特定途径的活性。丘奇说，这种方法对脑研究也非常有用，例如记录基本记忆所涉及的通路的活动。 “此方法可用于将临时过程转变为永久记录，并将其呈现给大脑中的所有神经元细胞。”