动物造模,认知功能障碍,血凝酶 中国实验动物信息网 2020-09-10 483

　　背景：认知功能障碍是中风患者生活质量低下的主要原因，而中风以其高发病率，残疾，死亡率和复发率而臭名昭著。然而，由于其复杂的病理机制和狭窄的治疗时间窗，在临床实践中没有有效的治疗策略。因此，需要进一步研究其潜在的信号传导机制，并采取新的有希望的干预措施来减轻中风引起的认知功能障碍。新证据表明，缺血再灌注（I/R）损伤在中风的发展中起重要作用。当发生I/R损伤时，内皮细胞的损伤和功能障碍会导致对血脑屏障的破坏，从而加剧I/R损伤。此外，高铁血红蛋白在大脑I/R期间释放的自由下摆是内皮细胞的毒性成分。在已建立的体外和体内模型中，自由下摆对皮质神经元和星状细胞有毒。血凝素（HPX）是一种60 kDa的血清糖蛋白，由中枢神经系统细胞局部合成。 HPX对下摆具有*高的结合亲和力，可用作过量有毒下摆的有效清除剂。我们以前的研究表明缺血再灌注后24小时，半影区神经元和星状细胞中下摆的表达增加。 MCAO后7天内，脑室内注射HPX可减少梗塞体积并改善神经功能测量。缺血和再灌注后，HPX的神经保护作用持续了7天。血氧合酶1（HO-1）是分解游离下摆的速率决定酶。新证据表明，HO-1在保护血脑屏障免受脑梗塞中起重要作用。此外，HO-1可以上调循环内皮前体细胞（EPC）的数量，并减少缺血再灌注损伤对多个器官的损害。在这项研究中，我们调查了HPX是否可以改善与脑缺血再灌注损伤相关的认知功能障碍，并设计了一个实验来确定其是否与HO-1相关。

　　方法：动物：SD大鼠（7-8周大，体重250-280g），将所有动物随机分成组（假手术组，n ＝ 36； MCAOn ＝ 36；媒介物组，n ＝ 36）。 HPXn = 36； HPX + ZnPPIX，n = 30）。在假手术组中的大鼠进行了假手术，另一组进行了MCAO，并且在实验后通过腹膜内注射戊巴比妥钠（200mg/kg）对它们进行安乐死。手术：大脑中动脉闭塞（MCAO）方法用于诱导局部脑缺血再灌注（I/R）损伤模型。简而言之，大鼠必须在手术前禁食12个小时，并通过腹膜内注射水合氯醛（10％，3 ml/kg）进行麻醉。接下来，在腹中线颈部切开一个切口，并确定右颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），并从周围组织中仔细解剖。在CCA和ECA的近端结扎后，将手术细丝插入ICA，直到感觉到轻微的阻力。这表明大脑中动脉（MCA）被阻塞，流向MCA供应区的血液暂时停止，然后发生脑梗塞。用4-0缝合线缝合皮肤并缺血1小时。然后去除外科手术丝，再灌注过程开始。在整个过程中，大鼠的体温保持在37±0.5°C。 脑室内注射：再灌注后，将大鼠麻醉并像以前一样置于立体定向框架中。头骨用四个不锈钢螺钉固定。头皮切口露出颅骨和前.。在右颅骨上打一个洞（在Bregma外面1.5毫米，后面0.8毫米）。在硬膜表面下方3.5 mm处缓慢插入25μL微量注射器，生理盐水（10μl，MCAO组大鼠为0.9％氯化钠），赋形剂（10μl），大鼠血凝素参考血清（10μl） ）注射1.86μg/ L溶于0.16叠氮化钠的HPX）或混合溶液（对于HPX + ZnPPIX组中的大鼠，10μl，1.86 g/L HPX + 20μMZnPPIX）。停药前，将微注射器放置5分钟以观察注射的效果。停药后，将切口缝合以使大鼠从麻醉中恢复。 Shamrat接受了同样的手术，没有受到MCAO损伤或脑室内注射。

　　莫里斯水迷宫（MWM）分析：MWM分析包含两个部分：空间探测器测试和隐藏平台测试。简而言之，测试系统由一个充满水的四象限圆形水箱（直径210厘米，高50厘米）组成（温度保持在19-22度，深度为30厘米）。 ..整个实验过程中都使用墙上的彩色卡片。不断。在太空测试中，一个黑色的目标平台被固定在西南方格中心水面以下1 cm处，因此该平台对老鼠是不可见的。如下所示，每只大鼠连续五天每天进行四次测试，两次测试之间间隔5分钟，如下所示，并在象限位置随机释放。每次测试的*长时间为120秒，使大鼠可以在水箱中自由游泳以找到隐藏的平台。发现隐藏的平台后，老鼠在平台上休息了30分钟，并记录了作为逃生潜水在搜索平台上花费的时间。如果鼠标在120秒内未找到平台，则研究人员将其放置在平台上30秒钟，记录逃生延迟为120秒。经过5天的测试，完成了隐藏平台测试。在此测试中，我们移除了上面隐藏的平台，以观察并记录在目标四边形（quad quad SW）中花费的时间（时间百分比）和平台相交点的数量。计算机视频跟踪系统以MWM记录逃生潜伏期，时间百分比和跨平台数量。 Western印迹分析：缺血-再灌注后7天，以液氮迅速冷冻的局部缺血周围区域的脑组织被迅速收获，以大鼠为代价。然后用含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀（ripa）分析缓冲液（Sigma Aldrich）研磨缺血性半影脑组织，得到蛋白质提取物。将来自每组样品的等体积（40μg）的蛋白质样品上样到10％十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶的每个通道中，通过电泳分离，然后电转移到PVDF膜上。在室温下用5％脱脂奶封闭2小时后，将膜与以下主要抗体一起孵育：抗HO-1（兔多克隆，1：1000稀释度），抗VE酪蛋白（兔多克隆，1：3000稀释度）和抗兔β-肌动蛋白（兔多克隆抗体，以1：1000稀释），在4°C轻轻摇动过夜。用TBST洗涤膜3次（每次5分钟）后，将其与相应的山羊抗兔抗体（1∶11000）一起温育，并在室温下观察结合抗体2小时。将蛋白质印迹浸入增强化学发光（ECL）试剂中，观察特定蛋白质的条带，然后将其暴露于ECL。免疫荧光染色：再灌注7天后，在腹部麻醉后处死大鼠。如上所述对大鼠进行腹膜内麻醉，并用添加了肝素的生理盐水进行心外灌注，然后用4％多聚甲醛进行心外灌注。灌注后，处死大鼠，从颅骨中取出脑组织，植入OCT培养基中并保存在80°C。冷冻的脑组织的冠状切片（8μm）用免疫组织化学染色。 CD31和vWF是两种内皮细胞标记物。脱蜡和脱水后，将其用3％的过氧化氢的甲醇溶液处理30分钟，以抑制非特异性内源性过氧化物酶的活性。通过将切片在10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中煮沸10分钟来回收抗原。接下来，将CD31（1：100）和vWF（1：100）与山羊单克隆抗体（mAb）在4°C孵育过夜。然后将切片用PBS洗涤，并与生物素化的抗山羊IgG（1：100）在37℃下孵育2小时，洗涤切片，然后与抗生物素蛋白过氧化物酶结合溶液（1：100）孵育1小时。我会。*后，将其用二氨基联苯胺冲洗5分钟，并对阴性对照组进行类似处理，但不使用*抗体。  CD31和vWF测量：使用vWFf和CD31免疫荧光染色确定脑损伤后的血管密度和CD31阳性细胞数。在这里，用光学显微镜（200x）分析了五个50 mm的脑组织切片。计算病变和受损海马边界区域的vWF阳性血管。将免疫反应性血管除以相应区域，以确定这两个区域中的血管密度和CD31阳性细胞数。脑血屏障通透性：BBB通透性使用伊文思蓝（EB）颜料溢出法评估。 MCAO后两天和安乐死前一小时，通过股静脉注射EB（2.5％，2 ml/kg）。用4％多聚甲醛灌注后，取出大脑，并在60°C的二甲基甲酰胺中孵育24小时。然后将脑组织匀浆并以1000pm离心5分钟。测量梯度剂量伊文思蓝的吸光度并绘制标准曲线。在625nm处检测上清液的吸光度，并计算EB的相对含量。如前所述，脑含水量通过干湿法测量，并表示为湿重的百分比。荧光定量PCR：使用Trizol从上述冷冻的脑组织中提取总RNA。 Smartspec？用Plus分光光度计在260nm OD下测量总RNA浓度。使用cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用现成的qRT-PCR混合物以50μL的体积进行RT-PCR扩增。所有操作均在三个并行测试中执行。

　　统计分析：我们使用统一的弥散分析（ANOVA）和Tukey的后检验比较了三个患者组中MNSS，MWM和脑组织的血管密度。 P值为0.05被认为具有统计学意义。

　　结果：HPX改善局部脑I/R损伤后大鼠的长期空间学习和记忆能力：假手术和局部脑I/R损伤的前5组空间探针测试的基线逃逸延迟（？24小时）没有太大差异。与假手术组相比，MCAO组在局部探针I/R损伤后2-7天的空间探针测试中具有更高的潜伏期。 MCAO组在目标象限中花费的时间和隐藏平台测试中的跨平台数量显着低于假操作组。与载具组相比，HPX组从局部探针I/R损伤后的第二天到第七天显着减少了空间探针测试的逃逸潜伏期。在目标象限中花费的时间和隐藏平台测试中的跨平台数量已显着增加。局部脑I/R损伤后2-7天，HPX + ZnPPIX组的空间探针测试的逃逸时间明显长于HPX组。 HPX + ZnPPIX组显着减少了在目标象限中花费的时间以及隐藏平台测试中跨平台的数量。但是，MCAO和赋形剂组在逃避潜伏期，在目标象限中花费的时间以及隐藏平台测试中的跨平台数量方面没有显着差异。 HPX治疗组缺血半影中HO-1的表达上调：与假手术组相比，MCAO组局部缺血半天后7天的缺血半影是HO-1的表达上调。 HO-1蛋白的表达增加。在HPX组中，HO1蛋白表达明显高于MCAO和载体组。然而，MCAO和赋形剂组之间HO 1蛋白的表达水平没有显着差异。

　　HPX改善局部脑I/R损伤大鼠缺血半影区海马血管生成的形成：与假手术组相比，MCAO组在局部脑I/R损伤后7天，缺血性半影变浓，在黑暗的海马中有新血管。局部脑I/R损伤后7天，接受HPX治疗的患者与媒介物组相比，缺血周围海马新血管的密度显着增加。对局部脑I/R损伤的大鼠给予HO-1、ZnPPIX和HPX抑制剂后，局部脑I/R和HPX组7天后，缺血性周围海马的血管生成密度增加相比之下，密度显着降低。然而，在MCAO组7天后，在载体组中，局部脑I/R损伤和缺血周围海马新血管密度没有显着差异。

　　HPX可以防止由于血脑屏障（BBB）功能受损而导致的局部I/R损伤：在局部I/R损伤后7天评估BBB的通透性，脑完整性和新血管为了稳定性，我们评估了脑室内注射HPX对减少BBB的结构和功能损伤的作用。结果表明，与假手术组相比，伊文思蓝染色液的渗出明显增加，MCAO组的血脑屏障通透性增加。此外，在局部脑I/R损伤的大鼠中，通过水含量（表明BBB完整性）测得的脑水肿程度比假手术组重，并且与血管稳定性Ang1/Ang2相关该比率已大大下降。 VE-钙粘着蛋白在内皮细胞迁移和存活，血管生成以及维持血管完整性方面起着重要作用。 MCAO后VE-cadherin的表达低于假手术组。与载体组中的大鼠相比，HPX组中伊文思蓝染料的浸出，水含量和VE酪蛋白水平显着高于载体组。同样，在比较MCAO和HPX组时，这些更改是一致的。在用HPX和ZnPPIX（HO-1拮抗剂）治疗的大鼠中，HPX对BBB功能的积极作用被阻断。结论：HPX可以通过HO-1途径减轻局部性脑缺血再灌注损伤后的认知功能障碍，并防止损伤大鼠的血脑屏障。