中洪博元,动物造模,脑缺血 中国实验动物信息网 2020-07-21 2203

　　在脑缺血再灌注损伤的实验研究中，建立适当的动物模型至关重要，其直接影响实验结果的可靠性与稳定性。对于脑缺血再灌注动物模型的复制，一般采用阻断血流一定时间后再恢复血液灌流的方法。常用实验动物有沙土鼠、大鼠、家兔、小鼠、狗、猫等。目前为止，复制脑缺血再灌注损伤动物模型的方法已有十几种之多，本文对其中几种常用的造模方法进行归纳，并分析、比较其利弊与适用性。

　　1全脑缺血再灌注损伤动物模型的建立方法

　　1.1双侧颈总动脉阻断法

　　该方法通过阻断双侧颈总动脉一定时间后再恢复血流，造成全脑脑缺血再灌注损伤。优点是非常简便易行。但是，由于常用实验动物中除沙土鼠外均有比较完整的大脑动脉环(Willis环)，且沙土鼠也只有大约20%～30%的动物大脑Willis环发育不全。所以，单纯阻断双侧颈总动脉难以造成完全脑缺血。因而，该方法所导致的脑缺血再灌注损伤成功率低，使用范围有限，一般只用于沙土鼠脑缺血再灌注损伤模型的制备。

　　1.2双侧颈总动脉阻断合并循环降压法

　　采用夹闭家兔双侧颈总动脉合并股动脉(兔子、猫、狗等体型较大的实验动物)或眼眶后静脉丛[2]（小鼠）快速放血，造成急性脑缺血模型。脑电图、生化指标和形态学检测显示，这种模型脑缺血效果明显。但是，该模型不易进行再灌注观察。有作者采用双侧颈总动脉阻断合并控制性药物（硝普钠等）[3]降压法，制造急性脑缺血模型。缺血一定时间后可恢复血液灌流，用于脑缺血再灌注损伤观察。由于全身低血压可造成心、肾和其他重要器官的损害，导致模型复杂化。

　　1.3体循环控制性降压复合颅内注液增压法

　　通过给狗快速滴注0.02%硝普钠溶液，使其平均动脉压(MAP)于2～3min内降至6.65kPa；之后向小脑延髓池快速注入脑脊液近似溶液，使颅内压(ICP)于5s内升高至13.3kPa。这样由于降低MAP而使脑灌注压下降，同时升高颅内压使脑灌流阻力增大，导致脑血流阻断，造成脑缺血。维持MAP及ICP于上述水平一定时间后，颅内减压使ICP降至正常水平，即可恢复血液灌流。经组织学、生理学、生物化学及放射性同位素等多项技术检测，证明应用体循环降压结合颅内增压技术制造的脑缺血再灌注损伤模型，具有缺血效果可靠、并发症少等优点，可用作脑复苏的实验研究。但该模型不适用于大鼠等小动物，并且也具有因全身性低血压导致其它脏器损伤，而使模型复杂化的缺点。

　　1.4四血管阻断法

　　Pulsinelli等于1979年首先报道了采用电凝固大鼠双侧椎动脉合并结扎双侧颈总动脉，一定时间后再解除两侧颈总动脉结扎进行再灌注，从而造成严重大脑缺血再灌注损伤这种具有高度可重复性的全脑缺血造模方法。李麟仙等在此基础上加以改进，采用直视下分离家兔两侧颈总动脉和椎动脉、夹闭四动脉造成脑缺血。该方法简便易行，是研究脑缺血再灌注损伤比较常用的动物模型。但由于椎动脉与脊髓前动脉间有交通支，并且动物不同种属和不同个体之间差异较大，模型的成功率较低，稳定性亦较差。

　　1.5三血管阻断法

　　Kamegama等通过电灼断基底动脉、同时夹闭两侧颈总动脉的方法复制全脑缺血模型，由于该方法不仅阻断了脑供血主干血管，而且也阻断了从脊前动脉来的侧支血管，与前述四血管阻断模型比较，脑缺血成功率高且无需再筛选是其主要优点。田鹤屯阝等在此基础上又加以改进，不用显微镜而在直视下进行手术，用特制的动脉夹夹闭基底动脉而不用电灼断的方法。缺血一定时间后可去除夹闭进行彻底再灌注，也避免了灼断基底动脉导致的动脉损伤、出血之弊，造成的缺血和再灌流效果迅速、稳定性好。使用过程中全身动脉血压一直稳定在生理范围内，从而避免了由全身动脉压降低引起再灌流时脑血流灌注压不足是其又一个比较突出的优点。

　　1.6六动脉阻断法

　　在四血管阻断法造模的基础上加以改进，将传统的双侧颈总动脉阻断改为双侧颈内动脉和颈外动脉阻断再加双侧椎动脉阻断。该方法由于颈动脉阻断的部位是在颈动脉窦的远心端，使颈动脉窦区能维持一定的压力。这就避免了传统的四血管法阻断双侧颈总动脉，因双侧颈动脉窦区压力同时骤降，导致全身血压反射性升高，引起脑侧支循环开放增加和脑血流增加，进而使脑缺血程度减轻等弊端。但该方法手术过程比较复杂、难度较大。

　　1.7颈动脉分流法

　　采用结扎左侧颈总动脉、同时从右侧颈总动脉远心端放血，使大脑由两侧颈总动脉来的血供停止，制造全脑缺血模型。此时虽然两侧椎动脉的血流仍能通过基底动脉流向大脑Willis环，但由于从右侧颈总动脉远心端进行放血，引起该侧颈总动脉、颈内动脉和后交通动脉压力显著降低。因而，当基底动脉的血流进入后交通动脉后，并不向前灌注大脑，而是逆行经颈内动脉的颈总动脉流出，导致大脑缺血。从颈总动脉放出的血液又经同侧股静脉输入体内。整个过程中可有效地控制血液流量和速度。该模型的优点在于不影响基底动脉和椎动脉的血流量，脑干缺血不明显，对呼吸、循环等基本生命活动的影响较小。再灌流时，停止右颈总动脉放血，使右颈总动脉、颈内动脉和后交通动脉的低压消失，由基底动脉来的血流能够进入Willis环；同时解除左侧颈总动脉结扎，恢复其血液灌流。这样，大脑便有了足够的血液灌注，即再灌流充分是其又一特点。但对于这种造模方法所导致的脑缺血范围尚有争议。有研究显示，这种缺血主要是右侧大脑中动脉供应的脑区缺血。造成这一差异的原因可能与放血速度、颈内动脉压力降低程度不同等有关。

　　1.8颈动脉负压分流法

　　实验大鼠以戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉。从左股静脉注入肝素(180U)后缓慢注入生理盐水，夹闭两侧颈总动脉，从右颈外动脉持续抽吸颈总动脉内血液(0.3ml/min)，此为脑缺血开始；同时，自左股静脉持续回输血液，全脑缺血20min后停止抽血，向颈动脉内注入1ml生理盐水，结扎颈外动脉，松开两侧颈总动脉，此为再灌注开始[4]。

　　2局灶性脑缺血再灌注损伤造模方法

　　建立大脑局灶性缺血与再灌注损伤动物模型，是研究缺血性中风的病理生理机制及其防止的重要手段之一。大脑中动脉(MCA)是人类脑梗塞的血管病变多发部位。由于大鼠脑血管解剖接近人类，血管性损伤恒定，重复性好等优点。因而大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型是比较公认的研究脑缺血损伤的标准动物模型。对于局灶性脑缺血模型的制备，目前比较常用的有开颅法、插线法、光化学诱导法和栓塞法等造成大鼠MCA血流阻断与再通，从而导致其相应灌流区域局灶性脑缺血再灌注损伤。

　　2.1开颅法

　　多数研究选择颞下部开颅，通过电凝或丝线结扎横过嗅束外缘或内缘处的MCA，造成脑梗塞。Kader等对电凝闭塞MCA方法加以改进，闭塞MCA所有可见分支，梗塞效果更好。开颅法MCAO模型缺血效果可靠，是迄今应用*广泛的经典局灶性脑缺血模型。但开颅创伤大，脑脊液外漏，易感染，改变了脑微环境，手术难度较大和MCA闭塞后无法观察再灌注损伤效应。虽然有作者通过用微型动脉夹夹闭或通过穿线抬起MCA造成短暂脑缺血，然后使血流再通制作再灌注模型，但也只限于短时间MCAO后再灌注损伤的研究，技术上尚待进一步改进。

　　2.2插线法

　　2.2.1Kuizumi于1986年首次报道了尼龙线插线法制作的可逆性MCAO模型，解决了局灶性脑缺血再灌注损伤研究的难题。该模型的制备方法是将动物麻醉后仰卧固定于手术台上，采用颈部正中切口或选择右侧颈部切口，分离一侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。结扎颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。分离颈内动脉至鼓泡处可见其颅外分支翼腭动脉，穿线沿起点结扎分支。在颈外动脉剪一小口，将制备好的尼龙线插入颈外动脉经颈总动脉分叉处进入颈内动脉，通过MCA起始端至大脑前动脉近端(插入深度平均约18.5±0.5mm)。再灌注时外拉此尼龙线使其球端回至颈外动脉内，即可恢复MCA血供进行再灌注。若手术选择颈部旁侧手术入路，可使手术视野暴露更好，便于血管分离；并且较颈部正中切口对气管刺激小，无需再行气管造瘘，使手术相对较简单。病理检查结果显示，造模动物均存在缺血侧尾壳核及背外侧皮层梗塞，病变一致、稳定性好，缺血效果可靠。尤其适用于基底节缺血再灌注的病理生理机制的研究和药物治疗效果与机制的观察。此外，无需开颅、创伤小，栓线闭塞MCA后不引起血压、血气和体温的异常变化，不影响缺血后脑水肿和颅内压病理变化的自然过程等优点，均优于开颅闭塞MCA法建立的局灶性脑缺血模型。

　　2.2.2Zea Longa线栓法

　　该模型的制备方法是将动物麻醉后，颈后正中切开，电烧双侧椎动脉局阻断后循环；前正中切开，暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈内动脉（ECA），以微血管夹将CCA夹闭，将单股尼龙线（4-0）插入ICA远端，大脑中动脉起始部阻断血流。平均进线长度为（2±0.2）cm[5]。

　　2.3光化学诱导法

　　一般选用Wistar大鼠，麻醉后经左侧颞部入路(右侧MCA起始段的变异较大)，暴露卵圆孔上方鳞骨下份隆起，在颧弓与颞鳞骨接合处的前端2mm处开一直径为5mm的骨窗，切开硬脑膜，可见MCA近侧段跨越嗅束。可选择MCA起始部或嗅束内侧2mm至与大脑下静脉交叉处为光照部位。应用光化冷光源仪(金属卤化物灯)进行分步照射：经股静脉注射3%的玫瑰红B(或其它光敏材料)后，立即持续照射MCA自嗅束到近大脑下静脉之间的血管部位15min(局部光照强度为0.5W/cm2)；之后，将光源移至MCA起始部，再注入等量玫瑰红B并持续照射MCA15min，即可形成单纯MCA闭塞模型。其原理是玫瑰红B在绿色光源作用下产生并释放单态氮，使血管内皮细胞多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应而直接损伤血管内皮细胞，导致血栓形成使局部血管闭塞。一定时间后，在光照局部滴注20μmol/L的尼莫地平20μl，2～10min后血管内血栓物质即消失，使血管再通而形成再灌注。由于血管无机械性损伤，易于再通，再灌注充分，灌流量可达100%。造模时选择MCA起始端和嗅束内侧2mm至与大脑下静脉交叉处血管，进行分步照射，不仅闭塞了MCA的近侧端，而且亦阻断了由其发出的豆纹支，可导致大脑皮质及基底神经节前外侧和后分的梗塞。通过光化学诱导MCA闭塞与再通模型的主要优点是：①成功率高，所造成的梗塞灶比较稳定、重复性好；②该模型梗塞形成与病理情况下因脑动脉血栓形成导致脑梗塞的发病过程较为相似，尤其适用于抗血小板、抗血栓药物和内皮细胞保护剂的研究。但是该方法需要特殊设备，而且形成的缺血灶多因毛细血管内皮损伤所致，与临床上大血管栓塞形成的缺血区有较大差异[6]。

　　2.4栓塞法

　　这种造模方法是将栓塞剂(如碎血凝块、碳素颗粒、花生四烯酸盐等)注入血管，制成脑栓塞模型。将无菌干燥的血凝块研碎，制成栓子混悬液。从颈外动脉注入栓子后，结扎颈外动脉并放开总动脉，栓子冲入颈内动脉并进入MCA。该模型不需开颅，制作简单，缺血效果可靠。且与临床栓塞性脑卒中病理过程*为相似，比较适用于溶栓治疗的观察研究，尤其选用人血凝块作为栓塞剂更具有实用意义。其缺点是由于栓子的随机性较大，无法精确预测梗塞的部位和范围大小。也有研究人员应用气囊栓塞法，但仅能用于大动物如狒狒，家兔等。

　　2.5Endothelin-1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型

　　Sharkey等建立了ET-1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，国内外已有多人采用该法进行了缺血性脑损伤的研究。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml·kg-1)麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪上，以热垫维持肛温37.0～38.0℃，沿正中线切开头皮暴露颅骨，参照大鼠脑立体定位图谱以前囟为标志，头端0.9mm，右侧开5.2mm，颅骨下8.7mm处植入ET-1导管，5min后将ａCSF稀释的不同浓度ET-1(4.0μl)以1.0μl·min-1速度注入到MCA附近；同时行尾动脉插管术监测给ET-1前、后大鼠尾动脉血压变化。与普遍应用的插线法相比，本模型仅涉及简单的立体定位和开颅术；不会造成脑内较大动脉的损伤，减少了颅内出血的危险；再灌注的发生是一个渐进过程，避免了人为再灌注引起的CBF急剧增加，较符合人类脑卒中溶栓后CBF逐渐恢复的情况;开颅范围小(直径0.65mm)，不会造成脑内环境的较大变化；可产生与插线法类似的较稳定的梗死范围且具有良好的重现性；此外，本模型的*大优点是可以对清醒动物进行缺血性脑损伤的研究，因此本模型对脑缺血再灌注机制的研究及脑保护新药疗效的评估而言是一种较理想的局灶性脑缺血再灌注模型。