动物造模,丙泊酚 中国实验动物信息网 2020-09-09 755

　　简介：丙泊酚是*常用的静脉诱导麻醉和维持麻醉。低氧血症是麻醉过程中常见的并发症。在先前的一项临床研究表明，轻度低氧血症（Spo2 86-90%）的发病率为53%。手术室和麻醉后ICU分别占55%，和血氧饱和度<81%的严重低氧血症分别为20%和13%。未补充氧气的丙泊酚麻醉引起的呼吸暂停会导致血氧饱和度逐渐减少，进一步缺氧，甚至死亡。我们之前已经证明丙泊酚本身或低氧本身并没有直接诱导显著的神经元凋亡。然而，丙泊酚引起的呼吸抑制可在空气中或轻度缺氧条件下产生较低的血液氧浓度，从而导致神经元变性。我们同时发现丙泊酚本身诱发短期认知障碍；然而，丙泊酚联合缺氧严重损害新生大鼠的认知功能。另外，丙泊酚会导致LTP受损。LTP，涉及记忆形成的机制在海马体中已被广泛研究。但丙泊酚对低氧条件下LTP的影响是未知的。. 在本研究中，我们模仿临床用药和输氧研究丙泊酚麻醉对空间记忆、神经元凋亡、幼年大鼠海马体CA-l区长期增强的影响。

　　动物：使用7日龄的幼龄SD大鼠（12-16g）。84只大鼠随机分为6组（n=14），丙泊酚或对照组。丙泊酚组大鼠。暴露于50%氧气（丙泊酚组-氧气，PO）、室内空气（丙泊酚组-空气PA)，或18%氧气（丙泊酚组-缺氧，PH），腹腔注射50 mg/kg丙泊酚。对照组大鼠暴露于50%的氧气中(对照组-氧气 CO)。室内空气（对照组-空气，CA）或18%氧气（对照组——低氧，CH）和腹腔注射相同体积的（ip）脂肪乳剂（5.0 ml/kg）。麻醉组或对照组均连续7天每天注射一次。血氧饱和度（%）和呼吸频率（RR）均为全程监控。

　　免疫组化：*后一次注射24小时后，每组随机抽取6只幼崽。选择用于激活caspase-3的免疫组化。麻醉动物灌入10 U/ml肝素盐水。随后，灌注含4%的甲醛的PBS，这些程序可以保护神经元的抗原性和防止组织液化。大鼠取脑后，海马CA1被分离并分成小块。小块固定在多聚甲醛中，石蜡包埋，然后切割成冠状物，截面5μm厚。这些石蜡切片依次用于脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记（TUNEL）和免疫组化。组织切片在二甲苯中脱蜡，然后经过梯度乙醇漂洗，然后在100°C的微波炉中在柠檬酸钠缓冲液中回收抗原10分钟，并冷却至室温。使用组织染色试剂盒进行实验。用3,30-二氨基联苯胺进行显色反应。使用的主要抗体在1:200稀释液中用于活化caspase-3。用苏木精复染并用树脂固定。根据TUNEL试剂盒的说明基于末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸盐原位刻痕末端标记进行TUNEL染色。

　　场兴奋性突触后电位记录和LTP诱导成功率检查：*后一次注射24小时后，动物在异氟烷（2%）和笑气（N2O，70%）麻醉下被处死。心脏灌注20ml脑脊液。将大脑迅速置于0–4°C血氧饱和度的切片液体中1–2分钟。我们用振动仪切片切出400微米厚的双侧海马脑，把切片放在含有以下物质的混合液（单位：mM）：124 NaCl、26NaHCO3、1.25 NaH2PO4、2.8 KCl、2 CaCl2、2 MgSO4和10葡萄糖，，用95%O2和5%CO2进行氧化。气体不断地鼓入混合物中，在35°C下培养30–45分钟。孵育期后，切片放置在室温下，1h。

　　场兴奋性突触后电位记录：海马切片在35°C下以1.5 ml/min的速度连续灌注氧饱和度记录液。将双极钨刺激电极（直径0.01 m m，间距10μm）放入海马CA3区。刺激强度为0.1-0.25 mA，脉冲宽度为0.5 ms。我们将玻璃记录电极放入CA1区域辐射层，记录电刺激诱导的场兴奋性突触后电位（场兴奋性突触后电位或FEPSP）。使用PCLAMP 9.2软件对样品进行处理和保存。

　　LTP诱导成功率检测：选择FEPSP诱导的*大反应值为50%的刺激强度作为基本刺激，在基础稳定30分钟后给予高频LTP诱导电刺激。高频电刺激后，fEPSP斜率增加20%以上，且持续30分钟以上。认为是LTP诱导成功。共有两组高频电刺激参数。频率为100Hz，脉宽为0.5ms 100脉冲，每组间隔为30s。

　　Morris水迷宫：Morris水迷宫试验包括位置导航试验（PNT）和空间探针试验（SPT）。我们使用位置导航测试和空间探针测试来测试每只老鼠获得空间学习和空间记忆的能力（n=8）。水迷宫实验设计是一个不锈钢圆形水箱（直径100厘米，深50厘米），装满水（24±0.5°C）。我们使用一个视频跟踪系统来记录每只大鼠的游泳动作，并分析了使用MWM运动检测软件获得的数据。

　　位置导航测试（PNT）：在产后第28天，即进行正式的MWM测试的前一天，我们将大鼠放入游泳池2分钟进行一次适应试验。大鼠连续6天每天接受4次采集试验（T1-T6）。在场地试验中，大鼠被放置在游泳池四个虚拟象限中的一个，面向墙壁，随机放置在游泳池中。下一次试验前，采用试验间隔，让大鼠在平台上站立60 s。在每次试验中，我们都使用计算机跟踪系统来测量游泳速度、花费的时间（逃逸潜伏期）和到达平台所经过的距离（逃逸路径长度）。逃逸潜伏期被记录为120秒。我们将120秒内没有找到平台的动物放在逃逸平台上。

　　空间探针测试（SPT）

　　为了检查空间参考记忆，在*后一次训练后24小时进行了探针测试。在探针测试期间，我们将平台从池中移除，以测量先前平台位置的空间偏差。我们将每只老鼠放在训练平台位置对面的象限中，跟踪老鼠120秒，测量上一个目标象限中花费的时间百分比以及上一个平台位置上的交叉口数量。

　　结论：丙泊酚引起呼吸抑制：丙泊酚麻醉时监测血氧饱和度和呼吸频率。与对照组相比，所有丙泊酚治疗的动物均有呼吸窘迫症状，呼吸频率显著降低。丙泊酚处理的动物暴露于空气和轻度缺氧时，其体内的Sao2水平显著降低。有趣的是，当丙泊酚治疗动物补充氧气时，与对照动物相比没有显著变化。结果表明，丙泊酚在空气环境下可引起呼吸抑制和随后的缺氧。

　　丙泊酚在空气和轻度缺氧条件下诱导神经元凋亡：在我们的实验中，丙泊酚导致了在空气和轻度缺氧条件下大脑细胞凋亡的显著增加。CO、CA、CH、PO组中TUNEL阳性细胞较少，PA、PH组凋亡指数明显升高。肺动脉和肺动脉的凋亡指数PH组明显高于CA、CH组（P<0.05），PA、PH组的TUNEL指数平均值高于PO组（P<0.05）。

　　caspase-3表达:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在PA和PH组海马中的表达显著上调。与对照组和PO组相比，PA组和PH组的免疫组化明显增强。

　　缺氧条件下fEPSP与LTP成功率的降低:场兴奋性突触后电位:在相同的电刺激强度下，CO、CA和CH组的fEPSP振幅无显著差异。与对照组相比，丙泊酚组大鼠fEPSP波幅降低，PA和PH组fEPSP波幅降低明显高于PO组。PO、PA和PH组的fEPSP降低。三个对照组之间无显著性差异。

　　LTP成功率:将高频刺激前的fEPSP斜率定义为基准值。对照组大鼠HFS后fEPSP明显增强，LTP诱导成功率达60%。结果显示，治疗组fEPSP明显增强，HFS后LTP成功率约为43%。PA组和PH组的EPSP无明显变化，LTP的成功诱导率分别为31%和22%左右。与对照组相比，丙泊酚治疗大鼠LTP成功率降低。PA和PH组LTP的成功诱导率均低于PO组。

　　丙泊酚暴露对缺氧条件下长期空间学习记忆的影响:与CO组相比，PO组*天和第二天的RR降低，平均逃逸潜伏期明显延长。与CA组相比，PA组的平均逃逸时间较长，平台位置穿越次数减少。与CH组相比，平均逃生潜伏期较长，平台位置穿越次数在PH组明显减少。与PO组相比，PA组和PH组逃生潜伏期较长，平台位置穿越次数减少。CO、CA和CH组没有明显的差异。

　　结论：综上所述，丙泊酚麻醉本身会导致认知功能的短期损害，但丙泊酚联合缺氧会导致新生大鼠认知功能的长期损害。重复丙泊酚麻醉对LTP的影响更为显著，在空气条件下的进一步学习和记忆障碍比补充氧气条件下的更长。得出结论：缺氧导致新生大鼠麻醉后认知功能损害，说明了麻醉过程中供氧对预防患者术后认知功能障碍的重要性和必要性，尤其是儿童。