糖尿病干眼症,动物造模 中国实验动物信息网 2020-09-09 534

　　背景：泪液不足性干眼病（TDDE）或水性干眼病（DED）是指与病理生理学和/或环境因素有关的泪液分泌异常。它是一种多因素疾病，以泪膜体积变化和眼部不适为特征，可能具有炎症成分。如果不治疗，严重的DED可能导致疼痛、角膜溃疡和潜在的视力丧失。即使是更温和的DED也可能导致慢性不适和视力模糊。由于女性、老年和自身免疫性疾病（特别是1型或2型糖尿病）而增加了患病风险。大多数治疗都是非处方（OTC）或处方润滑剂（人工泪液、凝胶、软膏），其成功取决于频繁使用。许多治疗只提供暂时缓解，大多数不针对潜在的疾病病理学。具有炎性病因的TDDE的常用处方治疗方法是含有环孢菌素活性成分的restasis（rx）和Lifitegrost（xiidra），后者是2016年FDA批准的淋巴细胞功能相关抗原-1拮抗剂。这两种疗法都是针对炎症引起的干眼症的外用药物。Restasis?的功效有限，需要长时间使用（例如，4周）才能生效。与OTC人工泪液、凝胶、凝胶插入物和软膏相比，可以提供暂时缓解、类固醇加载的泪点塞或通过及时咬合的外科治疗来维持慢性干眼症患者泪液潴留的基本水平。因此，迫切需要新的局部处方治疗。临床前研究报告，阿片类生长因子（ogf）–ogf受体（ogfr）调节途径在逆转或改善糖尿病的几种眼部相关并发症中发挥作用。对正常动物角膜伤口再上皮化的广泛研究证实了OGF在细胞内稳态中的整体作用。NTX阻断ogf-ogfr相互作用的额外研究显示糖尿病小鼠和大鼠角膜伤口愈合加速。临床前报告表明，局部应用溶于Vigamox的NTX可逆转干眼症，并在单滴眼液数小时内恢复1型和2型糖尿病动物模型的泪液生成和眼敏感度。

　　方法：NTX-001 1型糖尿病干眼症疗效研究

　　动物和1型糖尿病的诱导（T1d）：雄性SD大鼠，体重约160g。选择雄性大鼠进行本实验，以保持与先前发表的糖尿病并发症NTX治疗研究的一致性。连续两天腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素（ph 4.5），使动物血糖升高。血糖水平>250 mg/dl表示高血糖和1型糖尿病（T1d）。非糖尿病大鼠被视为正常对照组，注射无菌生理盐水。动物在血糖升高5周后使用。T1d大鼠的入选标准为：（i）与非糖尿病雄性大鼠相比，体重至少下降10%，（i i）血糖水平>250 mg/dl，以及（i i i）正常大鼠的基线Schirmer值低于平均Schirmer评分的70%。

　　治疗：将t1d大鼠随机分为治疗组，每天两次（~ 08：30和~ 16：00），仅对右眼滴眼液（~ 0.02 ml/滴眼液）（i）20μg/ml NTX（NTX-001），（i i）缓冲液/赋形剂，或（i i i）5×10?5 M NTX溶于Vigamox中。对照组包括：（i）T1d大鼠左眼未经处理；（i i）仅接受赋形剂的T1d大鼠右眼或左眼；以及（i i i）正常动物的右眼或左眼。每天治疗持续10天，在*次注射STZ后8周内完成。

　　泪液体积的测量：使用Schirmer条测量泪液体积。使用无菌的单刃刀片将标准Schirmer条带预切至1 mm×17 mm长，并按照公布的程序进行测量。将条带插入1 min。使用校准单位为毫米的细尺测量每条条带的湿润长度，精确到半毫米。治疗（2-4 h）后，收集用NTX-001、赋形剂或Vigamox?治疗的T1d大鼠的Schirmer 1测试分数。在96 h和7 d对经NTX-001或缓冲剂治疗的大鼠进行额外测量。停止治疗后，每天测量大鼠的泪液量，以确定干眼何时恢复。

　　角膜表面灵敏度的测定：角膜敏感度采用耳蜗帽式感觉计测量。对每只动物进行四次测量，并取平均值；终点为眨眼反应。数值（g/mm2）直接从制造商的换算表中确定。在接受赋形剂或NTX-001治疗的T1d大鼠和正常动物治疗后48小时和240小时（10天）测量角膜表面敏感性。

　　眼内压：在研究结束时，测量糖尿病大鼠治疗组的眼压（IOP）。简言之，未经麻醉的大鼠测量眼压。平均眼压是从每只眼睛4个读数中获得的。

　　NTX-001对正常大鼠和兔的安全性研究：大鼠安全性研究：10只雄性SD大鼠（126-150g）。治疗方案在7天后开始，包括每只大鼠每天接受4滴（每滴0.02 ml）专有的NTX-001制剂（20μg/ml），在8:30给右眼2滴，在16:30 给2滴药。每天治疗两次，持续30天，动物安乐死（>150 mg/kg戊巴比妥钠）后，眼睛用戴维森改良的固定剂支撑和固定。组织技术人员用石蜡包埋眼睛（瞳孔视向），切片并用苏木精和伊红染色；玻片以隐蔽的方式贴上标签，由兽医眼科病理学家进行评估。用光学显微镜检查每一部分，看是否有因服用试验剂而产生的不良反应。每个切片的可比解剖结构包括：视神经、脉络膜、视网膜色素上皮、神经视网膜、睫状体、晶状体、角膜、前房和后段以及眼外结构。

　　兔安全性研究：10只雄性2公斤新西兰白兔。5只兔子每天服用4滴NTX-001配方，持续30天。右眼08：30滴2滴（每滴0.05 ml），16：30 滴2滴。5只兔子每天两次右眼滴入2滴药物，两组的左眼均未接受治疗。30天后，对兔实施安乐死，并肌肉注射30–40 mg/kg氯胺酮和3–5 mg/kg甲苯嗪进行镇静，然后耳静脉注射戊巴比妥（>150 mg/kg）。用含福尔马林的戴维森改良固定剂固定眼部组织。固定切片染色后由病理学家观察。

　　结果：T1d大鼠的临床特征：高血糖症由体重和血糖水平确定。注射STZ时大鼠平均体重为165±2 g。开始研究时，正常大鼠体重为386±21 g，而T1d大鼠体重为324±7 g。滴眼开始时，T1D大鼠血糖测量值为530±24 mg/dl，正常动物为119±6 mg/dl。基线Schirmer试验显示，T1d大鼠的右眼和左眼与2.5 ±0.1 mm的测量值具有可比性；正常大鼠的右眼和左眼与6.7 ±1.3 mm的测量值具有可比性。角膜敏感度T1d大鼠为0.95 ±0.06 g/mm2，正常大鼠为0.47± 0.05 g/mm2。在p<0.0001时，T1d和正常大鼠的基线之间的所有比较均显著不同。21只T1d大鼠符合干眼症的标准，10只接受ntx-001治疗，8只接受vigamox+ntx治疗，3只T1d大鼠只接受赋形剂治疗；5只大鼠为非糖尿病大鼠，正常（n）。在本研究中，正常大鼠的泪量较低，这很可能与5月至7月实验期间动物设施内的低湿度有关；然而，正常大鼠的泪量大约是T1d的2.5倍。

　　NTX-001可恢复T1D大鼠低泪液：滴一滴NTX-001后4 h内，与基线泪液量相比，接受NTX-001或Vigamox治疗的T1d大鼠右眼泪液量增加；一滴赋形剂对泪液量无影响。接受ntx-001或vigamox治疗的T1d大鼠右眼的泪液生成与相应的未治疗眼不同。治疗96小时（8滴）后，接受vigamox-ntx（3.6±0.3 mm）或ntx-001（4.3±0.4 mm）治疗的t1d大鼠相对于t1d基线大鼠（2.6±0.1 mm）的泪液体积显著增大；接受ntx-001治疗的t1d大鼠相对于赋形剂（2.7±0.1）治疗的泪液体积也恢复了。

　　NTX治疗后角膜敏感度恢复：用耳蜗-帽感觉计测量角膜敏感度的基线值，结果显示，T1D大鼠的右眼和左眼具有可比性。在4滴NTX-001（初始治疗后48小时）和10天后测量角膜表面敏感性。4滴NTX-001治疗后的t1d大鼠右眼角膜敏感度恢复正常，与接受赋形剂的T1d和T1d大鼠基线相比，测量值有显著差异。在10天的治疗中，经NTX-001治疗的右眼相对于非糖尿病正常大鼠的角膜表面敏感度仍然相当，因此需要显著降低力测量值，以引起相对于基线T1d值或接受缓冲液的T1d大鼠的响应。

　　NTX-001治疗后的眼压:经10天治疗后，NTX-001治疗眼（18.5 ±1.9 mmHg）的眼压值与正常大鼠（17.2 1.6 mmHg）的眼压值相当；未经治疗的T1D眼的眼压值为10.9±0.7 mmHg。10天后，局部给药NTX-001结束，并对每日接受NTX-001的大鼠亚组进行改良的Schirmer 1试验，以确定恢复性泪液产生的积极作用何时消失。使用3.0分或以下的分数表示治疗结束后24小时恢复“干眼”，8只大鼠中只有1只出现“干眼”。48、72和96 h时，在接受NTX-001治疗的其余7只大鼠中，分别有50%、20%和75%的大鼠检测到表明干眼恢复的低泪液量。

　　大鼠安全性研究：大鼠病理学，没有发现任何眼睛有炎症、肿瘤或退行性改变的迹象。三只眼睛出现轻微变化。两只大鼠右眼前房和一只大鼠左眼可见少量非晶态嗜酸细胞碎片，一只眼睛可见一个小的视网膜（外核层）花环。所有这些都被认为是无临床后果的发育性损伤。每天第二次使用（7-8小时后）时，没有观察到使用后立即出现的痛苦迹象（如尖叫、哭泣、流泪或发声），也没有观察到治疗后的眼睛发红或结痂。在为期30天的研究结束时，大鼠的眼睛看起来很清澈楚（没有白内障），没有过度的流泪。

　　兔安全性研究：总的来说，视神经检查不充分。滤过角在正常解剖方向可见。晶状体存在，但有时在切片中碎裂。可见不同结构的单个细胞类型（包括视网膜色素上皮），核和细胞质。病理报告显示，没有证据显示任何眼睛出现肿瘤或退行性改变。两眼结膜轻度或轻度炎症改变，均未接受治疗。在一个月的治疗过程中，兔子没有发现眼睛异常，也没有红肿、水肿、刺激、过度流泪或干燥的迹象。在滴眼液或给药后，兔没有疼痛或痛苦的迹象。研究结束时，所有家兔都健康，视力正常。

　　结论：本研究报告一种新的GLP兼容的NTX外用制剂，对糖尿病大鼠逆转干眼和恢复角膜表面敏感性有显著作用。用该制剂进行为期30天的局部治疗，每天两次，对幼年大鼠和兔子的眼睛进行大体和组织病理学研究，未发现任何异常。总之，这种新的配方在临床前研究中是有效和安全的。