动物造模 中国实验动物信息网 2020-09-08 634

　　简介：临床医生会治疗严重的面部和眼睑烧伤，导致严重的眼外伤，导致视力丧失和/或失明。不仅这些损伤还普遍存在碱性或酸性物质，占眼外伤的11.5～22.1%，化学和热损伤是临床上*难治疗的。在化学烧伤的情况下，碱烧伤更严重和苛刻，因为碱剂渗透眼部组织更迅速，由于亲脂性性质。这导致组织坏死和缺血，从分子的观点来看，暴露于碱性化合物会导致细胞膜中脂肪酸的皂化，因为它们穿透角膜基质并破坏蛋白聚糖和胶原蛋白。当角膜碱烧伤愈合时，受损组织分泌蛋白水解酶，造成额外和持续的组织损伤。由于这些原因，角膜碱烧伤患者的临床康复往往是非常有挑战性的，由于长期发生的角膜上皮糜烂和慢性炎症导致视力丧失的长期并发症。面部破坏性烧伤患者经常会对眶周组织（即结膜、眶周脂肪、腺体和眼睑）造成损害。无论患者是否遭受化学烧伤或热烧伤，当眼表面未及时愈合时，由于这些损伤而可能发生的视力损失是相同的。因此，临床医生需要更*的治疗方法来治疗这些患者。虽然羊膜，颊皮移植，睑板缝合术（部分缝合眼睑），绷带隐形眼镜可作为治疗，这些治疗对*严重的眼烧伤患者均失败。在严重的创伤中，局部治疗如抗坏血酸滴剂、柠檬酸盐滴剂、皮质类固醇或绷带隐形眼镜可以联合羊膜移植、角膜缘干细胞移植或角膜移植来解决任何角膜瘢痕或不透明度。当不能通过角膜缘干细胞移植修复稳定的眼表时，可能需要进行角膜移植。然而，尽管有干预措施，经常出现不理想的结果。此外，依赖局部滴眼液管理是不够的。局部滴眼液在滴注后几乎完全消散，也必须经常使用。已经开发了一种新药消除伤口给药的需要，同时促进伤口愈合。该药物递送系统是一种专有的巯基化交联透明质酸（CMHA）聚合物，用于眼部使用，已被证明加速光折变性角膜切除术后伤口闭合。此外，当用作液体凝胶时，由于独特的工程，这种聚合物在眼表面上停留时间超过2小时。然而，这种聚合物也可以制造成薄的、柔性的膜，其可以插入下穹窿，以提供治疗剂的持续释放。交联CMHA-S是一种多功能的生物相容性聚合物，它将HA的记录伤口愈合特性与药物输送能力相结合，在快速安装到眼表面时提供一种创新的眼科治疗。由于这种聚合物的内在愈合特性，我们研究了这种新的CMHA-S治疗方式来治疗*具挑战性的眼部化学烧伤，碱化学损伤。

　　方法：动物：雄性新西兰兔（2.5～4公斤），随机分组（每组5只）。三个治疗组由未受损伤的眼睛接受CMHA-S膜的动物、角膜碱烧伤的动物接受CMHA-S膜治疗和角膜碱烧伤未接受CMHA-S膜治疗的动物。所有动物手术均在麻醉动物上进行。

　　瞬膜去除：在角膜碱烧伤创面或膜放置前三周取出瞬膜。在瞬膜去除前，盐酸氯胺酮（35～45 mg/kg）、丁丙诺啡（0.5 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）通过肌肉注射（IM）给药，动物置于异氟醚（1～3.5%）中。0.5%盐酸丁卡因麻醉家兔左眼。用PBS稀释的聚维酮碘溶液（5 %至10 %）对手术部位进行消毒。钳夹夹持瞬膜，注射0.1～0.2毫升盐酸利多卡因，肾上腺素1100000 USP注入瞬膜后、前基底。韦斯科特剪刀用于去除瞬膜。用WEK-CEL海绵去除血液，用高温烙术烧灼手术部位。在手术部位应用杆菌肽锌和硫酸多粘菌素B眼膏。动物被放置在氧气室（39 - 40%氧气）中以恢复。每天检查动物两次，治疗三天，治疗疼痛，三周愈合。

　　角膜碱烧伤：在1N NaOH中浸泡52, 175μm厚，0.015%灰，圆形滤纸60秒后，将它们放在麻醉兔的中央角膜上30秒，角膜碱烧伤直径5.5毫米。用卡尺测量角膜以确保中心烧伤创面，创面立即用10毫升平衡盐溶液冲洗并清创。

　　CMHA-S膜的放置：将在PBS的巯基羧甲基HA溶液（*终浓度为16 mg/ml）与聚二丙烯酸酯溶液（PBS）（*终浓度为15 mg/ml）相结合，制备了CMHA－S薄膜。得到的溶液被引用到硅树脂模具中（3 mm宽×9.9 mm×1 mm厚），交联2小时，室温干燥。。在再水化时，CMHA-S薄膜表现出溶胀，产生长方形、透明和柔性的薄膜，宽4毫米，长15毫米。干燥的CMHA-S膜在无菌BSS中部分再水合两分钟，然后放置在左下穹窿中。一些膜在放置前暴露在0.1%的玫瑰孟加拉染料中，用于可视化。

　　角膜成像：在0小时，48小时，96小时，和受伤后第14天，利用照相机（7D）用100毫米的宏观透镜获得图像。用100μL无菌BSS消毒的无菌荧光素钠眼药膜USP对角膜伤口进行染色。荧光素溶液被允许保留在眼睛上10秒，然后用BSS冲洗。钴蓝染色后摄取图像。通过使用Image J软件来量化伤口闭合的面积和角膜混浊的面积。每一时间点与伤后0小时比较。荧光素成像后，获得光学相干断层扫描（OCT）图像。用Image J软件测量中心角膜*宽部分的OCT图像。在未受伤的健康对照动物上获得体内共焦显微镜图像，但由于角膜混浊而不能在受伤角膜上获得。

　　组织学：从安乐死兔的眼球摘除第14天的组织学，在改良的戴维森溶液中固定24小时，然后转移到10%中性缓冲福尔马林。组织石蜡包埋，切片（3～4μm），用苏木精和曙红（H＆E）或马松三色染色。

　　结果：下穹窿保留CMHA-S：虽然先前的研究已经证明了交联的CMHA-S在滴式制剂中促进角膜修复的能力，但在水凝胶膜中的CMHA-S是否仍保留在下穹窿中作为有效的治疗尚不清楚。因此，保留膜是我们研究的一个重要部分。在下穹窿放置96小时后，膜被安全地保留并具有生物相容性和结构完整性。对膜的每日总观察表明，虽然膜没有完全降解或溶解，但一些膜表现出轻微的磨损和撕裂，这可能是由于眼球运动的机械力所致。没有动物由于放置膜观察到任何刺激，红肿，或眼或眼结构肿胀。

　　CMHA-S膜具有生物相容性：将CMHA-S膜置于未受伤的健康眼睛的动物的下穹窿中，并与健康未治疗的对照组（无CMHA-S膜）作对照。在CMHA-S膜放置后14天进行白光成像、荧光素染色、体内共聚焦显微镜和角膜表面组织学检查。白光成像未发现角膜混浊的征象。缺乏荧光素摄取表明任何一组没有角膜上皮缺陷。HE和马松三色染色也未发现任何病理变化。

　　CMHA－S膜治疗导致角膜混浊面积减少：烧伤创面放置CMHA-S后，在0小时、48小时、96小时和第14天拍摄白光图像，观察角膜混浊。在48小时，我们的结果显示，在CMHA-S治疗的眼睛中，角膜混浊面积下降了17%，而未治疗的碱烧伤则减少了0%。96小时，CMHA-S治疗眼角膜混浊面积下降30%，非治疗组角膜屈光度下降4%。这种差异随着时间的推移而不断增加。受伤后第14天，CMHA-S治疗的眼睛中观察到50%的明显不透明度降低，而未治疗的损伤则出现16%的总体下降。研究结果显示，CMHA-S治疗的创伤与未治疗的损伤相比，角膜混浊的面积明显减小，两组之间的差异随着时间的推移而增加。

　　CMHA-S膜促进角膜上皮化：在角膜碱烧伤后0小时、48小时、96小时和第14天拍摄荧光素图像，并放置CMHA-S膜，通过荧光素摄取检测角膜上皮缺损。在伤后48和96 h和第14天用CMHA－S膜处理的荧光素摄取较少。荧光素在48小时的摄取表明，CMHA-S处理的伤口在48小时表现出99%的RE上皮化，与未处理的对照伤口约86%的再上皮化相比，在CMHA-S处理的伤口上的上皮再上皮化率提高了13%。

　　CMHA-S治疗的碱烧伤显示角膜肿胀减少.

　　CMHA-S治疗碱烧伤显示角膜肿胀减少：为了确定用CMHA-S膜治疗对角膜总厚度的影响，在损伤后0小时和第14天采集OCT图像。OCT图像显示0小时角膜厚度无差异，两组角膜厚度平均为400μm。第14天，烧伤组CMHA-S治疗组角膜厚度（779μm±70）和未处理烧伤组角膜厚度约（975μm±67），差异有统计学意义。

　　两组治疗后角膜表面组织学均正常：中心烧伤后H＆E染色显示伤后14天CMHA-S治疗和未治疗烧伤的角膜病理学差异无显著性。未观察到新生血管，炎症反应*小。H＆E切片显示，在第14天摘除时出现一薄层上皮，但两组均未恢复到全厚度。

　　结论：CMHA-S的水凝胶的形式已被证明有利于角膜碱烧伤后上皮的再上皮化。CMHA-S膜可能是一种可行的治疗，以促进上皮再上皮化，同时减少角膜混浊和肿胀。