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帕金森,动物模型
中国实验动物信息网
2020-07-17
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为模拟人类PD，理想的动物模型应具备以下一些特点：(1)多巴胺能神经元在出生时数量及形态正常，青年时期开始逐渐选择性地减少，减少量超过50％，且容易通过神经化学和神经生理学的方法检测到；(2)模型应能容易检测其运动功能的损伤，包括运动迟缓、肌僵直和静止性震颤等PD的主要症状；(3)模型应能显示出路易小体的形成；(4)如果模型是遗传性的，应基于单一突变而使突变模型有着强大的传播能力；(5)模型应有相对较短的疾病周期(如数月)，以使药物筛选得以经济、快速地进行。
国际通用国内应用较多是两种方法：①通过在大鼠的黑质或内侧前脑束注射6羟多巴胺（6-OHDA）②通过对模型动物(如:猴、小鼠、猪等)进行1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）的管饲法和立体定位注射等方法。前者是较精典的模型制备的方法，也是在国内较早开展的，但是其存在①神经元的毁损出现的较早，这与临床PD病人的中脑黑质多巴胺能神经元的渐进性死亡不同②近距离的毁损很难把握毁损的程度，这使得采用这种方法获取部分损毁的模型的成功率很低；较之前者采用MPTP管饲法和立体定位注射方法，在国内*近几年才运用到帕金森动物模型的制备，国外已经利用MPTP在猴和小鼠身上建立了较为理想的PD模型，制备通常采用皮下、静脉、腹腔注射和肌肉给药，具有方法可靠且重复性较好。但是其危险性较高，对于试验人员和试验条件有着严格的要求[1]。
模型制备
应用6-经多巴胺制备PD模型
1968年Ungenstdet首先报道采用6-经多巴胺(6-OHDA)在大白鼠造成帕金森病动物模型．该动物旋转模型的某些特点和人类贼金森病相似。近来，人们根据6-OHDA的注射部位及注射剂量不同，来造成模拟不同阶段帕金森病的动物模型。
注射6-OHDA来制备帕金森病鼠的步骤[2]：
1）实验选择体重250~300g健康雄性Wistar大鼠36只来制备帕金森氏病的大鼠模型
2）大鼠用戊巴比妥（48mg/kg）腹腔注射注射麻醉
3）解剖操作 将麻醉后的大鼠固定于江湾I型C立体定向仪上，头部正中切口，剥离骨膜，止血。参照George图谱，用牙科钻在颅骨顶钻孔，定位坐标为：门齿与耳杆平行，前囱后3mm，旁开3.0mm，颅骨表面下9.0mm，将自制同心套管插入右侧NS区(套管外径0.7mm，内管外径0.4mm，内管比外管前端长1.5mm),用502胶和自凝牙托粉固定。
4）微量注射器吸6-OHDA溶液4µL(含9.0µg 6-OHDA和8.8µg抗坏血酸)，速度为1µg／min，注射后留置4min退出，缝合皮肤。
5）21天参照Francois的实验方法 (包括行动迟缓实验、抓握实验和尾强直实验记录强直症状的变化、震颤实验)记录帕金森氏病的三大症状．并记录肌电图变化，以鉴别大鼠模型建立是否成功。判断标准如下：①出现行动迟缓实验持续35min②抓握实验持续55 min、尾强直实验持续30min③震颤频率在48次／分以上和肌电图群放电位频率在4-8次／秒。
应用6-OHDA制备偏侧PD鼠模型[3]：
1）雄性Sprague-Dawley大鼠，体重230～250g
2）实验动物经戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，固定于立体定向仪(江湾I型C)上。
3）参照大鼠脑立体定位图谱,取两个靶点a点:前囟尾侧5.0mm，中线右侧1.9mm,硬脑膜腹侧7.4mm；b点：前囟尾侧5．3mm，中线右侧2.5mm,硬脑膜腹侧6.5mm)。将12µg 6-OHDA(Sigma公司)立体定向注射于右侧黑质a、b两个靶点(每点注射量6µg，浓度2µg／µl，溶解于含0.1%抗坏血酸的生理盐水中)。注射速度0.3µl／min．注毕留针15min。
4）行为检测 模型建立3周后，用阿朴吗啡(apomnphine，APO)按0.25mg／kg诱发大鼠向左侧(未损伤侧)旋转，记录半小时内旋转次数，选210转／30min(7转／分)以上的动物为成功PD模型
应用1-甲基-4-苯基－1,2,3,6四氢吡啶制备PD动物模型
灵长类PD模型［4］
恒河猴在戊巴比妥(40mg／kg)腹腔麻醉下，切开颈部皮肤，经钝性分离暴露一侧颈总动脉。对动物行颈总动脉注射，即将新鲜配制的MPTP(Sigma)按1.0～1.5mg／kg体重溶于2mL生理盐水中，逆血流方向缓慢注入血管中。若动物在第1次手术后PD症状不明显，故分别在每隔5d后又给予第2～4次注射，直至PD症状出现。用MPTP建立的灵长类双侧及偏侧PD模型，在症状、体证、病理、生化、对药物治疗的反应方面与人类PD的特征极为相似，被认为是*具代表性的PD动物模型。
MPTP用于帕金森病小鼠模型制作［5］
小鼠对MPTP的敏感性存在种系和年龄的差异。一般选10~12周龄，体重25~30g成年C57BL褐鼠，按体重30~40 mg／kg腹腔注射MPTP，连续7d。于第6~7次注射后出现暂时性(2~3h)躯干震额、竖毛、尾巴过伸、动作减少及爬杆试验障碍。
MPTP用于舶金森病小国模型制作时的一些注意事项［6］
a）小鼠种系对MPTP敏感性的影响 C57BL小鼠对MPTP*为敏感，而CF-W小鼠、FVB／N小鼠和Balb/C小鼠对MPTP的敏感性较C57BL小鼠稍差，CF-1和CD-1对MPTP的敏感性*差。目前较常用的小鼠为C57BL/6小鼠
b）鼠龄对MPTP敏感性的影响 老龄鼠较青年鼠对MPTP更为敏感，这种敏感性的差异不仅表现在顺处理后的老龄鼠能够呈现更为明显的黑质多巴胺能神经元数目的减少，而且还能在顺处理后的老龄鼠身上观察到蓝斑区肾上腺紊能神经元数目的减少以及较典型的帕金森病行为学方面的改变
其他建立模型的方法
利血平模型 利血乎主要可以通过抑制去甲肾上腺素能神经元末梢的再摄取功能，使囊泡内贮存的多巴胺(DA)及其他的儿茶酚胺类递质耗竭。将雄性Wistar大鼠(体重280—300g)腹腔内注射一定剂量的利血平后可使其出现骨伤肌慢硬、震颤、身体屈曲、运动过少以及其他的一些运动症状。神经化学分析发现大鼠纹状体内DA和其他单胺类递质的含量明显减少。因此．这类模型在一定程度上模拟了PD的临床表现和神经化学改变。但它存在明显的不足：一是药物注射造成的运动障碍在不同时间和不同个体之间变异性较大；二是利血乎同时引起了多种递质释放并且无法造成类似PD的病理改变。因此该模型的应用只局限于探索药物影响肌僵状态的实验中，对其他的运动症状的研究现已很少应用。
Fe3+模型 1991年Ben-Shachar在雄性SD大鼠(250~300g)单侧黑质内注射Fe3+三周后可使其出现明显的运动行为改变，表现为在新环境中自主运动减少，短暂的僵直症状及自发的同测旋转行为。安菲它明(AMPH)可使这种同测旋转行为加强。神经化学研究发现同侧纹状体DA含量平均减少95％，并且其代谢产物3，4—二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量也明显减低。组织病理学证实酪氨酸经化酶(TH)免疫染色阳性细胞大量减少，同时胶质细胞增生活跃。
机械损伤模型 研究发现机械损伤内侧前肋束(MF可以造成黑质内的DA能神经元进行性死亡。已经建立的造模方法有MFB独突切断术和中脑半切术，尤以前者应用较多。MFB切断术损伤模型的建立需要在大鼠脑立体定位仪上准确定住后，用特制的Scouten电线刀深入到MFB所在的部位将其切断。Brechne用此方法切断雄性CFHB大鼠(150～180g)的MFB后，分别于第1，2，4，6，10，16周计数DA能神经元的存活数目，发现约28％的黑质(SN)神经元在一周左右死亡，10周后约70％的细胞死亡。平均SN神经元存活数是29％。逆行追踪显示MFB切断成功率为92％～99％。可见，用该方法造模有如下优点：①成功率高，较为经济。②黑质DA能神经元呈现渐进性死亡，可以模拟PD病理变化的全过程，对于研究神经元的再生和PD的预防有一定的意义。缺点是切断术后短时间内，损伤的程度不稳定。
帕金森病小鼠模型行为学改变的定量观察
1）爬杆试验
2）悬挂实验
3）游泳实验
以上几种定量观察法为帕金森病小鼠模型行为学的研究提供了一些较为准确和客观的方法，同时也提高了整个实验的客观性。