标准化脑缺血动物模型的建立的方法

　　模拟人类缺血性脑血管病的发病过程，建立重复性好、生理指标控制严格的标准化活体脑缺血动物模型，始终是研究者们所追求的目标。随着缺血性神经元损伤与修复机制研究的日趋深入，对脑缺血动物模型的建立提出了更高的要求。在神经科学飞速发展的今天，尽管谈论脑缺血动物模型的规范化建立不是新话题，但却有重要的现实意义和必要性。

　　在脑缺血动物模型的研究，尤其是在动物模型制作过程中各种生理指标以及影响因素的控制方面，我们与国外存在较大的差距。

　　1．影响到国内脑缺血病理生理机制的深入研究

　　2．不利于我国脑保护药剂确切疗效的评价

　　3．研究结果无法得到国外同行们的普遍认可，研究论文也难以到国际一流杂志上发表和交流。

　　如何在现有的条件下建立标准化、规范化的脑缺血动物模型，并合理的、选择性的将其用于脑缺血损害的基础研究是值得探索的问题。分析目前国内脑缺血动物模型研究及应用的现状，仍然存在：

　　1．盲目选择动物模型的类型

　　2．麻醉剂使用不当

　　3．生理指标及影响因素控制不严

　　4．模型成功与否评判标准不一等现象。

　　原因

　　1.部分研究单位研究经费有限,无力匹配相应实验动物监控装备

　　2．少部分研究人员就各种生理指标及影响因素对脑缺血研究的影响认识不够，对各类脑缺血模型的形成原理以及特色认识不清，致使模型的选择及制作过程不规范，导致研究结论矛盾较大，重复性差。

　　目前，该现象已引起了国内科研管理机构以及专家们的普遍重视。1997年国家自然基金重点项目“缺血性神经元死亡机制及干预措施研究”的招标指南上明确提出了建立“标准化脑缺血动物模型”的要求。

　　脑缺血模型的正确选用是标准化的前提和基本条件。合理选用动物模型不仅能针对其特点扬长避短，而且还可以达到突出研究目的的作用。在脑缺血模型的具体选用过程中，首先要明确所选用模型的形成原理和特点,然后再根据其原理结合实验所需达到的目的来选用。

　　通常在轻度缺血/缺氧的情况，脑的补偿机制保护着中枢神经系统免受损伤，但当缺血程度加重时，便会发生不可逆的神经损害，导致系列的临床症状，甚至死亡。临床上，脑血管意外、心肌梗塞、休克、新生儿窒息和脑外伤都可引起神经元的缺血性损害。因此积极探讨脑缺血的损害机制及防治措施，具有重要的科学意义。一个生理上可控的和可复制的动物模型对于系统地、全面地研究脑缺血的病理生理过程和试验新的治疗方法是非常必要的。

　　首先，尽管临床上脑缺血的发病率很高，可以提供较多的病例。但是，人类脑缺血是非常多样性的，其表现形势、病因和缺血区的解剖学定位，有着很大的不同。这种多样性防碍了进行统计学分析和设置对照的可能性。

　　其次，精确的组织病理学分析、生物化学和生理学研究、常常需要侵入性的外科程序和直接的脑组织取样分析。

　　第三，发生在缺血性脑损伤早期事件的观察（几分钟甚至几秒钟），只能在实验动物身上才能做到。

　　*后，由于缺血是一种供血异常，血管因素在其中发挥了重要作用，而血管因素的改变无法用组织细胞培养或脑片孵育的方法来模拟。

　　因此，制作脑缺血动物模型在脑缺血损伤机制和药物治疗的研究中占居非常重要的地位。

　　通过脑缺血及脑缺血再灌注的比对研究，发现即使是早期再灌注也存在着再灌注过程中的继发性损伤问题，但与脑组织持续缺血所造成神经组织损伤相比，再灌注的损伤相对较轻。

　　一、合理选择实验动物及实验模型

　　由于大鼠具有成本低、种系内纯合性好以及与人类有类似的脑血管解剖特性等优点,因此，到目前为止，大鼠仍为脑缺血研究的常用实验动物。

　　此外,大鼠具有极强的抗感染能力和生命力,常规操作一般不会引起伤口继发性感染,而且动物存活时间相对较长，这些特性也给研究带来了方便。

　　注意在分析实验数据差异时既要考虑动物种系差异，同时也要考虑同一种系内的实验室来源不同及操作者的不同所致的差异。

　　Wistar大鼠和SD大鼠是我国*常用的鼠种，各实验者应该依据实际情况和已有经验选择鼠种。

　　1．Fischer-344大鼠大脑中动脉(MCA)变异较小,大脑中动脉闭塞(MCAO)后形成的脑梗死体积一致性好。一般报导的模型变异系数为20%

　　2．Wistar-Kyoto大鼠变异相对较大。模型变异系数为33%

　　3．Sprague-Dawley大鼠居于二者之间。模型变异系数为49%

　　4．蒙古种沙土鼠缺少连接颈动脉和椎-基底动脉系统的后交通动脉,用其制作单侧或双侧颈动脉(CCA)结扎脑缺血模型较为理想。

　　5．根据研究的目的选用兔、猫、狗和灵长类等大型动物作为研究对象。

　　6．国外近期有人提出，猪的脑血管解剖特性与人类相似，而且侧支循环较少，比较适合于脑血管病的基础研究。

　　二、脑缺血模型的种类

　　根据缺血的范围、损伤的形式，脑缺血模型可以分为多种类型。

　　根据缺血的范围，可分为弥慢性全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型；根据缺血程度，可分为完全性脑缺血和不完全性脑缺血模型；

　　根据缺血的时间，又可分为短暂性缺血和永久性脑缺血模型，

　　短暂性脑缺血又可进一步分为一次性短暂脑缺血

　　多次性短暂脑缺血模型。

　　此外，根据血流恢复的情况，分为缺血和缺血再灌流模型。

　　三、仪器和设备

　　一类是为动物手术服务，包括一套手术器械，手术显微镜，颅钻，脑立体定位仪，温度控制装置（控温仪、红外线灯和加热垫），呼吸机；

　　一类是用于监测和分析的仪器，包括脑电记录装置，血压记录装置，多谱勒血流记录仪，血气血糖分析仪。

　　四、血管结扎法动物模型

　　该模型常用作观察海马区

　　（一）双血管夹闭法动物模型

　　实验动物：沙土鼠

　　蒙古种沙土鼠缺少连接颈动脉和椎-基底动脉系统的后交通动脉,用其制作单侧或双侧颈动脉(CCA)结扎脑缺血模型较为理想。

　　该种动物模型一般用作前脑缺血的研究，用于海马缺血*常见，海马的CA1区对缺血*敏感，而且海马的神经细胞集中存在，便于观察。

　　缺点：实验动物难买

　　（二）四血管结扎脑缺血模型的制作

　　该模型选用Wistar大鼠、SD大鼠，Wistar大鼠常用此法。可以在清醒和自由运动状态下制作严重的脑缺血和恒定的病理学改变。

该模型分二个阶段制作

　　*阶段：

　　将动物麻醉，按置在脑立体定位仪上，调节耳杆和门齿高度使鼠头前倾约30度，同时用橡皮栓住鼠尾给以轻度的牵拉力，使颈椎伸直，翼孔呈水平位，便于观察。

　　枕骨下*颈椎水平正中切口，仔细分离两侧*颈椎横突，暴露*颈椎横突上的翼孔，翼孔下有两则椎动脉通过，用小的单极或双极电凝器插入翼孔烧灼闭塞双侧椎动脉。

　　然后动物取背位，颈部正中切口，分离颈动脉鞘，注意不要损伤迷走神经和颈动脉鞘后方的颈交感干。用外科缝线套住两侧颈总动脉（不要结扎），将线头藏于皮下，简单关闭切口。

　　第二阶段：

　　待动物麻醉清醒后自由饮水，但禁食12～24小时后，将动物于清醒状态下，取背位，分别用绳子固定四肢和门齿，以控制动物挣扎。小心分离颈前部的切口，辩认套在颈总动脉上的缝线，轻轻牵起，将线套收紧或者用微血管夹夹闭双侧颈总动脉。此时在2～3秒钟内大鼠将昏迷并丧失对光反射。缺血后2～3分钟可出现异常脑电图，并持续到缺血结束。

　　颈总动脉的关闭时间根据实验设计而定，通常取10～20分钟。昏迷和反射消失是缺血是否成功的标志。

　　此种方法手术复杂，创伤大，动物死亡率高。

　　缺血期间自主呼吸和角膜反射的存在提示脑干血液供应的存在，这是因为脊髓前动脉供血的原因。

　　缺血结束后松开颈总动脉，动物通常很快清醒。但在24～72小时内将有一部分动物出现缺血性抽搐，如果缺血持续30分钟，在24小时内将有20%、72小时有40%的鼠发生缺血性抽搐，这些发生抽搐的鼠应被排除。

　　鼠缺血不成功常见的原因：是昏迷不完全、死于呼吸衰竭、感染等。

　　该模型制作的关键是烧灼椎动脉，由于椎动脉不能直接看到，这就需要操作者具有一定的经验，适当的掌握烧灼的时间和电极与翼孔的角度，同时要避免损伤脑干。

　　五、局灶性脑缺血动物模型

　　局灶性脑缺血局限于脑的某一部位，在病理上有梗死中央区和其周边尚未完全坏死的区域，后者又称为半暗区，这部分脑组织可发展至梗塞坏死，也可通过及时再灌注及各种手段干预进行挽救。与缺血中心灶内神经元急性坏死相比，缺血半暗区侧枝循环的血流供应未完全中断，神经元有相对较长的抢救时间窗，半暗区神经元坏死是近年脑缺血损伤机制研究的热点之一。

　　好的局灶性脑缺血动物模型应该：中央坏死灶、半暗带和正常脑组织之间界线明显，可靠、稳定、重复性好，大鼠本身的生命状态、神经组织的变化所能显示的各项指标比较全面，便于多角度、多层次的研究各种干预手段对脑缺血再灌注的影响。

　　局灶性脑缺血动物模型有多种：

　　（一）开颅性的：

　　经颞下或经眶入路直接电凝或结扎大脑中动脉法，模拟了永久性栓塞性人类卒中。

　　优点：手术效果直观可靠，不受血管变异的影响。目前梗死灶*为均衡可靠、缺血效果*好的MCAO模型，也是目前国际上应用*广泛的经典局灶性脑缺血模型，适用于缺血后神经功能缺损、药物及康复治疗疗效评估等方面的研究。

　　缺点：动物手术复杂创伤大，脑脊液外漏，脑微环境改变，不能再灌注及感染机会较多，颅内的操作造成脑损伤，颅内压力平衡以及动物的咀嚼功能受影响等不利因素。

　　附着在MCA上交感神经纤维可因结扎或电凝而损伤，使血管的自调节功能受损。

　　方法：动物麻醉下，头皮切口，分离颞肌，取外眦和外耳门连线的中点，用牙科钻或环形颅钻钻开颅骨、暴露大脑中动脉，于手术显微镜下辩认大脑中动脉及其分枝，在分枝的下方即大脑中动脉（MCA）的近段，分离结扎或烧灼MCA，同时取颈部切口分离结扎同侧的颈总动脉。在分离结扎或烧灼MCA时，应避免损伤附近的脑组织，通常用钝头的直角钩子固定于定位仪上，操纵定位仪旋钮，轻轻地将MCA提起，然后烧灼或结扎。

　　该模型操作的关键有两点：

　　(1)精确的定位结扎部位：一定要在MCA的豆纹动脉分枝的下方，如果在其上方结扎将很少出现皮质和基底节梗塞灶。但是在实验操作时往往不能辩认出MCA的分支，此时可以嗅沟为标志，在其以下进行结扎；

　　(2)同侧颈总动脉的永久结扎，能够加重MCA供血区的缺血程度，是恒定的脑梗塞出现的必要条件，有时甚至配以暂时的对侧颈总动脉结扎。

　　（二）不开颅性的：

　　⑴颈内动脉注入微球或自身血制成的微小血块

　　该方法*大缺点是栓塞部位不恒定，动物实验结果的重复性差，实验结果的可靠性不好。

　　微栓子栓塞法脑缺血模型，由于其不能预见缺血部位和范围，不能再通，因此，仅限于溶栓治疗以及血小板微血栓形成后的脑病理改变等一些特殊研究。

　　⑵光化学诱导法脑梗塞动脉模型的制作

　　模型原理：光化学脑梗塞模型是一种新的局灶性脑缺血动物模型，其机理是某些光敏感染料注入机体后，在特定波长光波作用下发生光化学反应，产生并释放一些活性物质，如氧自由基等。这些活性物质造成血管内皮细胞损害、血小板粘附、进而发生释放反应，激发血管内凝血过程，导致血栓形成。

　　该方法形成的缺血灶多数是因为微血管内皮损伤，造成终末动脉闭塞，不同于人类大血管阻塞的病理改变，且此类模型不能再灌注，不适合于模拟人类脑梗死或溶栓药物治疗后血管再通方面的研究。与临床上多是由于大血管栓塞形成的缺血区发病机制有较大差异。

　　常用光敏染料：玖瑰红B（四碘四氯荧光素二钠，rose bengal）

　　操作过程：动物麻醉后用脑立体定位仪固定头部，光敏染料经尾静脉注入，数小时后切开头皮，用卤素灯或氙灯为光源，滤除红外及紫外光部分后，直接或经光学纤维传导投照到脑部。光线经过颅骨，对选定的皮质区域照射5～10分钟，局部照射强度为30～40k/x（千勒克斯）。照射数分钟即可见软膜及脑实质的血管内广泛的血小板聚集，血脑屏障破坏和血管源性水肿，血管内膜断裂，血管管径不规则，皮质深层神经元变性，上述病理改变以12～24小时*为严重，实验者可通过调整光束的照射范围、强度、时间和光敏染料的剂量来控制梗塞灶的大小和深度。典型的梗塞灶边缘整齐呈碗状，深入整个皮质并可延及皮质下结构。

　　优点：

　　1．定位准确，手术操作相对简便，避免了开颅和操作血管壁交感神经纤维的缺陷。

　　2．光化学诱导皮质脑缺血模型还具有皮质梗死面积和深度可调。

　　3．可选择性制作不同部位梗死的特点，为皮质功能定位研究提供了条件。

　　4．到目前为止，在所有的局灶性脑缺血模型中，光化学诱导皮质脑缺血模型的动物存活时间*长。

　　缺点：

　　1．微血管损害突出，早期血脑屏障开放和血管源性水肿明显，且不能进行重灌流。

　　2．光化学诱导血栓形成过程中，同时启动了血栓形成后的缺血性脑损伤系统和血栓形成过程中的血管内皮受损-凝血纤溶系统，因此，脑组织病理损害程度较其他脑缺血动物模型更为严重。

　　适用范围：

　　该模型适用于研究抗血小板药物、抗血栓药物和内皮细胞保护剂药物疗效的研究。

　　⑶血管内栓线技术（插线法）的局灶缺血模型

　　1986年日本学者首先发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型，1989年才开始有文献报导。我国1996年才有实验室开始使用，该方法不开颅，对动物损伤小，不需要特殊设备。

　　该法是在无需开颅的条件下产生局灶性脑梗塞，并且可通过拔出栓线实现血流再通。

　　国内外学者对它不断改进，对模型原理，栓线制备，动物选择和操作过程等各个环节和实验处理因素的认识都得到发展和改进。

　　目前，该动物模型被公认为实验性局灶性脑缺血标准模型，在国内外得到广泛运用。

　　但在实践中发现该动物模型的制备是一项较繁杂的系统工程，尚有一些问题未得到圆满解决。

　　缺血部位：

　　纹状体及所对应的大脑皮层

　　模型原理：

　　依靠插线的前端阻塞大脑前动脉根部，阻断经大脑前交通支的血流，依靠插线的侧壁阻断颈内动脉和后交通支的血流，从而使一侧大脑中动脉供血区的血流完全阻断。

　　大脑中动脉的深穿支是基底节区的重要供血动脉，其形态结构接近人类，亦是“易卒中动脉”。其皮层支分布到额区、顶区、以及梨状区，颞区，其供血区包绕了每侧半球60～70%皮层区域，这亦与人类相似﹙约占40%皮层区域﹚。

　　中动脉闭塞后其缺血坏死区包括：额顶背外侧皮层、尾状核、苍白球，部分试验结果显示还波及颞区和梨状区，比较符合人类大脑中动脉主干闭塞后的病理范围；

　　实验性脑缺血或梗死需要相应的脑血管闭塞。

　　大鼠脑血管闭塞的选择经历了四血管﹙双侧颈总动脉+双侧椎动脉﹚闭塞、三血管﹙双侧颈总动脉+一侧椎动脉﹚闭塞和双侧颈总动脉闭塞，*终发展到选择性一侧大脑中动脉闭塞。

　　由此而产生的梗死范围从弥漫性全脑缺血、前脑缺血，进一步缩小到局灶性大脑中动脉供血区缺血。

　　在人类，大脑中动脉供血区是卒中的高发区域。

　　大脑中动脉闭塞的手术入路改良经历了经眼眶入路、经颞窗开颅到经颈部切口线栓法的发展。实现从开颅到非开颅手术方式的转变。血流阻断方式由单一的永久性闭塞，进一步实现了缺血—再灌注。

　　大脑中动脉闭塞的方法有开颅机械闭塞法、线栓法、微栓子栓塞法、化学刺激导致血栓闭塞法、光化学诱导血栓形成法和内皮素灌注诱导血管收缩法等可供选择。

　　一般认为理想的实验性脑缺血动物模型应该具备其中以下条件：

　　能重复闭塞单根脑血管；

　　能引起相应供血区的血流量改变或梗死发生；

　　能实现缺血梗死区再灌注。

　　线栓法制备的局灶性大鼠模型能满足上述要求。

　　颈内动脉线栓法制备局灶性缺血大鼠模型亦几乎成为实验性脑缺血研究的首选动物模型。

　　线栓法引起缺血梗死的原理：

　　颈内动脉在走行中直径逐渐变细，而栓线直径没有变，栓线在插入过程中与颈内动脉结合趋于紧密，因此能逐渐减少、闭塞颈内动脉血流。栓线头端插入到大脑前动脉的起始部，并因其直径大于大脑前动脉起始部内径而停止在此。

　　大脑前动脉近段的血流被阻断，不可能回流入大脑中动脉。

　　而大脑前动脉远段尚可经前交通动脉得到对侧的代偿血流而不出现缺血改变。

　　大脑后动脉远端可经后交通动脉来的基底动脉系统代偿血流而不出现明显缺血改变。

　　因此，线栓法制备的缺血区主要发生在大脑中动脉供血区。

　　而大脑前动脉和大脑后动脉供血区基本还能保证较正常血流供应。

　　尼龙线的选择：

　　由血管内树脂灌注技术测量而得知颈内动脉颈部和大脑前动脉近端的内径分别为0.3和0.2mm。

　　插线过粗或过细，都会导致手术失败或结果不稳定。因此，插线的选择非常重要。

　　插线要有一定硬度和韧性，用镊子夹住线前端4mm处，扎自己的手背皮肤，能引起感觉但无痛感，线直而不弯，夹住前端长度超过6mm扎手背皮肤，插线即产生一定弯曲为选择标准。

　　插线前端的处理：

　　1．使用前通过加热使尼龙线的前端形成一个小的球形的膨大，便于推进。

　　2．将尼龙线在混有硬化剂的硅胶中浸一下以增加尼龙线的硬度。

　　3．将插线浸到硝酸里稍微软化一下。

　　4．指甲油法：将圆柱形尼龙钓鱼线剪成长30mm若干段，将其一端粘少许用酒精稀释合适浓度的指甲油，垂直倒放，自然凉干，于距处理端18mm、20mm处做黑色标记备用。

　　为了防止推进过程中出现凝血，用肝素处理一下尼龙线也是必要的。

　　插线的前端处理很关键，如插线前端不光滑，插线时易损伤血管内皮，血管内形成血栓，拔线后血流不能正常恢复，使再灌注失败。

　　操作步骤：

　　1．颈部正中切口，暴露、游离并结扎一侧颈总动脉。

　　2．分离结扎颈外动脉的分枝枕动脉、甲状腺上动脉和咽升动脉。

　　3．然后分离颈内动脉，注意勿损伤邻近的迷走神经和舌下神经绊。

　　4．游离颈内动脉（ICA）主干一段，穿线并扎活结备用，用无创伤微血管夹夹闭ICA。

　　5．沿ICA向后、向前分离枕动脉，在其起始处用电热烧灼器烧断枕动脉，小心分离颈内动脉在颈部的唯一分支翼腭突动脉穿线并悬起备用。

　　6．在靠近ECA、ICA分叉处剪开CCA一小口，将预先浸泡到浓度为2.4×106U/的肝素生理盐水中的插线栓子插入，收紧预先备好的活线结，松开微血管夹，缓缓通过ICA入颅，为了减少对血管内皮的损伤，使插线更精确方便，适度调整翼颚突动脉悬线的角度，至插线有轻微阻力感，表明栓子已越过大脑中动脉到达大脑前动脉起始端，完全阻断大脑中动脉血流，造成大脑中动脉供血范围的局灶性脑缺血状态。

　　以ECA、ICA分叉处为标志，一般插入深度为（18±0.5）mm。由于分叉处到大脑中动脉起始处的长度为14mm，这样尼龙线的前端进入了大脑前动脉，从而阻断了大脑中动脉的血液供应。而大脑前动脉可通过前交通动脉获得血流。

　　单纯大脑中动脉缺血的操作是剪去栓子留置于血管外的部分，逐层缝合切口。于缺血不同时间处死动物取材。

　　脑缺血再灌注的操作是将扎活结的线端及栓子的另一端留置皮肤外，逐层缝合切口。缺血持续不同时间缓慢拔出栓子，收紧活线结，大脑中动脉供血区即可得到前交通动脉、后交通动脉的血供，形成大脑中动脉供血区的再灌注状态，分别于再灌注不同时间处死大鼠取材。

　　翼腭动脉是否结扎可影响也可影响再灌注。

　　因为翼腭动脉结扎后，颈内动脉栓线周围容易形成血栓，导致管腔闭塞，影响再灌注时代偿血流的供应。

　　因此，缺血-再灌注大鼠模型不宜永久结扎翼腭动脉。

　　因此，线栓法操作的改良必需要在掌握了大鼠脑血管解剖，造模原理的基础上进行。不仅要考虑实用性，还要考虑是否能完全阻断进入大脑中动脉血流以及缺血后再灌注实现等问题。

　　缺血变性发生在大脑中动脉的核心供血区，即顶叶皮层和尾壳核外侧。若同时闭塞右侧的颈总动脉，结果缺血变性还出现在线栓侧的大脑前动脉和深穿支的侧支供血区额叶和尾壳核内侧部。

　　原因是对侧颈总动脉闭塞后上述的大脑前动脉—大脑中动脉侧支吻合提供的代偿血流减少，缺血持续1.5h以后，大脑前动脉侧支供血区也出现缺血改变。

　　由此可见，大鼠作为啮齿类动物与人类相比，其大脑背侧的大脑前动脉、中动脉和后动脉远端侧支吻合的退性形性变较不明显，其数量多，代偿作用强，对脑缺血能提供有效保护。

　　这就可以解释线栓法大鼠的神经功能缺陷为什么多在24h左右恢复？为什么青年大鼠在局灶性脑缺血造模中不能模拟出明显而恒定的缺血灶？

　　因此，制备出复制率高，病灶明显而局限，病灶恒定而变异小的脑缺血模型需要安全而有效地减少大鼠脑血管的侧支循环。

　　注意问题：

　　1．翼腭动脉﹙PPA﹚是否结扎的问题：

　　在线栓法发展史中对翼腭动脉是否结扎有着激烈的争论，形成了结扎派和非结扎派。

　　早期的线栓法倡导者认为翼腭动脉贯穿颅底的分支为基底节区提供侧支血流，因此，要实现大鼠额顶皮层和基底节区的梗死，必须闭塞该动脉。永久性翼腭动脉结扎则可较非结扎组的模型成功率提高26%～40%。

　　后来的学者在模型制作中也对该动脉进行暂时或永久性的闭塞。但其目的不再是闭塞侧支血流，而是为了提高造模成功率。

　　我们实际操作的经验是在手术过程中用微动脉夹暂时夹闭翼腭动脉，目的是防止栓线误入翼腭动脉而不能进入颈内动脉。

　　或者在翼腭动脉起始部穿一缝合线起到提拉的作用。当栓线接近翼额动脉时，提拉该栓线暂时对其闭塞，从而确保栓线进入颈内动脉。

　　因为翼腭动脉支从颈内动脉向前外侧分出，而且翼腭动脉较粗，与颈内动脉交角小，栓线容易进入翼腭动脉而无法进入颅内，造成造模失败。

　　随着线栓法研究的深入，更多的学者认为无需闭塞翼腭动脉。因为翼腭动脉位置深在，若结扎该动脉，神经肌肉损害严重，引起进食困难，给大鼠造成极大伤害，增加死亡率。

　　尤其在缺血—再灌注研究中不宜结扎该动脉。由此可见，对翼腭动脉是否闭塞的态度经历了永久闭塞、暂时闭塞和不闭塞三个阶段，其目的也改变了单纯侧支血流闭塞的追求，考虑到手术可行性，再灌注研究和对动物创伤等综合因素。

　　目前，能证实翼腭动脉的侧支循环作用的解剖资料虽然少，但是我们从实际经验中得出的结论认为不必强求永久闭塞翼腭动脉，只需暂时闭塞，这可兼顾脑缺血大鼠造模和再灌注研究，同时也明显降低手术难度，这对缺乏显微外科经验和条件的单位具有普遍适应性。

　　2．手术成功的关键：插线的直径要和大鼠体重的大小匹配。

　　随着大鼠体重的增加，血管的内径会相应增加。对不同年龄段的大鼠应该选择不同直径的栓线与之相适应，从而确保*大限度地阻断血流。

　　我们推荐的优化方案为：

　　线栓大鼠体重固定在250～300g，匹配韩国产直径0.2864mm的3号圆柱形尼龙钓鱼线，栓线插入深度17mm或18mm为宜。

　　体重＞350g，颅内血管增粗，难以完全阻断MCA血流。

　　体重＜240g，颅内血管过细，难以插入颅内血管。

　　3．大鼠鼠龄的影响

　　人类卒中多发生在已有卒中多重危险因素的中老年人群中，而卒中模型多选择年青、健康动物，这与人类卒中因素的相关性有差距。

　　这也可部分说明为什么动物模型证明有效的药物在人类临床实验中却无明显疗效。

　　因此，应该选择老龄动物作为卒中动物模型。

　　但常常有很多因素导致在线栓法实践中忽略该问题。

　　如我们作线栓法常用的大鼠体重为250～280g。

　　而大鼠体重与年龄存在着对比关系：

　　如体重250～290g大鼠的鼠龄为200～320d。因此，常用的线栓法大鼠大部分都不是老龄大鼠。

　　许多实践也证明选用体重更重或鼠龄更大的大鼠，线栓法的适应性下降。

　　如体重350～450g的大鼠行线栓法复制局灶脑缺血模型，尼龙线在插入过程中阻力明显，栓线扭结而很难到达预定位置。

　　体重大于350g的大鼠，常因颅内血管增粗，难以完全阻断MCA血流而影响造模效果，这也提示老龄大鼠不适合线栓法。由此可见，老龄大鼠用于线栓法实践还需要更多的实践检验。

　　模型成功标准：

　　动物清醒后出现同侧Horner征和对侧以前肢为主的偏瘫症状，表现为同侧眼球下陷，分泌物增多，眼睑闭合，头偏向对侧，对侧前肢不能完全伸展，爬行时向偏瘫侧转圈或倾倒，提尾倒立时身体弯向对侧，对侧前肢下垂无力。

关于Horner征的问题：

　　Horner征是交感神经纤维受损伤的表现，几乎所有的线栓法大鼠都出现Horner征，长期以来，它被认为是局灶性脑缺血引起的神经功能缺损表现之一。

　　但是Horner征不是MCAO模型成功的标志，只能提示颈内动脉的缺血性损伤。

　　因为大鼠的颈部交感干和颈内动脉、颈总动脉相伴行，交感神经纤维分布于颈内动脉上并入颅。在颈部手术和线栓操作中交感神经易受到损伤，故假手术组大鼠也可出现Horner征。

　　如果开颅法选择性闭塞大脑中动脉制备的局灶性脑缺血模型中Horner征却出现很少，这也说明它不是中动脉闭塞引起的可靠神经缺陷体征。

　　优点：

　　（1）不开颅

　　（2）不损伤血管的交感神经纤维

　　（3）效果肯定

　　（4）可准确控制缺血时间

　　（5）能进行再灌注及精确控制再灌注时间

　　因此，用其研究神经元对缺血的敏感性、耐受性以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想。

　　同时该模型对动物全身的生理功能影响较小，动物存活时间长，也适用于慢性脑损伤的研究。

　　TTC染色：

　　大脑缺血梗死灶显示苍白色，非梗死灶显示红色

经验：

　　不结扎颈内动脉在颈部的分支，不结扎翼腭突动脉并不影响大脑中动脉的栓塞效果，同时还可简化手术操作，减少颈内动脉的血栓形成，从而更有利于重灌流研究。

　　该模型实际上是机械性人工栓塞性卒中,与人群常见卒中发病过程存在差异。而且其手术操作过程较为复杂,许多细节如动物的品系和体重、栓子粗细以及插入深度处理不恰当均会明显影响实验结果。

　　六、自发性高血压鼠的脑缺血模型

　　使用自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensive rat,SHR)、老龄大鼠制作脑缺血模型或直接选用卒中型自发性高血压大鼠(SHR-strokeprone strain,SHR-SP)进行脑缺血研究，比较符合人类脑血管病的发病情况，该种脑缺血模型尤其适用于脑血管病分子机制、遗传特性以及危险因素方面的研究。

　　但此类实验动物目前所需费用较高。

　　1．自发性高血压鼠（SHR）

　　SHR大鼠是遗传性高血压大鼠，有许多品种。

　　*常用的为日本种SHR，由Okamoto从Wistar京都鼠中选择较高血压者经遗传定向选种繁殖而成，该鼠出生后数周开始自发性血压升高，峰值可达26.7kPa (220mmHg)。虽然SHR并不倾向于自发性卒中，但它们对脑血管闭塞较正常大鼠敏感很多。双侧CCA结扎可引起脑血流的明显降落，结扎SHR的大脑中动脉比正常血压大鼠产生更大的皮质梗塞灶。

　　2．在SHR基础上培育出的易卒中性高血压大鼠（SHRSP）

　　SHRSP大鼠血压更高，峰值可达32～33kPa，自发性脑出血或脑梗寒发生率可达60～80%。

　　其卒中发生的部位主要在前内侧皮质、枕皮质和基底节。

　　SHR和SHRSP的微血管病理学特征包括多灶性血脑屏障开放、血浆蛋白漏出、内皮损伤、血管平滑肌纤维样溃变、基膜增厚和成纤维细胞增殖。虽说结扎SHR和SHRSP鼠大脑中动脉可制作更大和更恒定的梗塞，但它们只代表遗传学上的一个小的群体，与原发性高血压患者的性质有很大差异，且这类鼠来源有限，饲养困难，在国内研究中无法大量开展。

　　七、脑缺血模型的测量指标

　　行为学

　　组织病理学

　　生物化学

　　生理学

　　分子生物学

　　具体地如何选择评价指标要根据实验者的实验设计，根据实验设计者所要实验的假说来决定。

　　一般的指标有死亡率、神经病学缺失、行为学损害、组织病理学损害等等。

　　1. 死亡率是一个比较简便的指标，在研究药物疗效时有一定的作用，但对于脑缺血机制的研究所提供的信息非常有限；

　　2. 神经病学缺失记分法：这是模拟人类卒中后的临床症状进行评分，但在实际应用中其指标间隔太大且客观性不够，应用受到限制。

　　例如大脑中动脉结扎后是否出现运动损害更多的是决定于缺血是否累及内囊而与梗塞灶的大小关系不大。

　　手术后6h对大鼠神经功能进行评分为0分及4分者为不合格，剔除不用。

　　Zea Longa 神经病学5分制评分标准：

　　无神经损伤体征：0分

　　对侧前肢、前爪不能充分伸展，显示轻度局灶性神经病缺失：1分

　　行走时向偏瘫侧转圈、旋转，为中度局灶性神经损害：2分

　　行走时向偏瘫侧倾倒，显示严重的局灶性神经损害：3分

　　不能自发行走，，并伴有不同程度的意识障碍：4分。

　　3.行为学指标

　　复杂的行为学指标对评价缺血损伤有一定的作用。

　　如逃避反射的跳台试验、Y型迷宫和Morris水迷宫等，但这类指标要求较高，需对研究人员和实验动物进行专门的训练，花费时间较长。

　　4．分子生物化学、组织病理学

　　许多研究人员选择更为客观的测量指标，如脑的糖代谢、组织病理学观察。

　　要注意的是这类指标的脑区间的差异较大，需同时进行多参数分析。

　　在上述指标中评价缺血性损害的金标准（gold standard）是组织病理学观察。

　　例如大脑中动脉结扎后，用脑梗塞灶体积的大小、半影区的大小来评价缺血损害的程度。

　　全脑缺血模型鼠海马CA1区锥体细胞丢失的数量或者纹状体内神经元死亡的数量来评价全脑一过性缺血损害的程度和某些实验干预措施的治疗效果。

　　八、影响脑缺血损害的相关因素

　　由于有许多因素可以影响缺血性脑损伤的过程和后果，因此，在制作脑缺血动物模型时应该对这些因素加以考虑并尽可能的加以控制，以保证脑缺血动物模型的成功和结果的恒定。影响脑缺血损害的调节因素主要有：动物的种类、血压、血糖水平、麻醉条件、缺血动物的体温和脑温。

　　1．脑缺血的程度和时间对脑损伤的影响

　　脑血流减少的程度和持续时间的长短是决定缺血损害的两个*重要的相关变量。

　　一般情况下，引起脑电图（EEG）上缺氧去极化表现的脑缺血持续几分钟就可引起所有动物种类某种程度的脑损害。

　　引起EEG缺氧去极化电位CBF的阈值（ml/100g组织/min）在不同的动物有所不同，通常在大鼠CBF低于正常值的35～40%，大的动物低于25～30%，持续几分钟即可引起缺氧除极化。

　　阈下缺血一般引起的脑损害是可逆的，但这类缺血时间持续过长，也可引起选择性神经元坏死，甚至脑梗塞。

　　因此，脑血流减少的程度和持续时间决定了缺血时脑损害的发展进程和结果。

　　为了控制动物之间的变异和提高缺血损害的可复制性，缺血动物的CBF和EEG将被监测，EEG可用电生理记录仪，CBF可用激光多谱勒血流计或者氢清除率的方法测定。

　　表1 缺血程度和时间对脑损害的影响

　　缺血时间（min）缺血程度（%对照CBF）

　　35～45%＜35～40%

　　0～30可逆性功能紊乱

　　选择性神经元坏死

　　～60选择性神经元坏死

　　梗塞

　　＞60梗塞

　　梗塞

　　2．体温和脑温对缺血性脑损伤的影响

　　缺血和缺血再灌流期间动物的体温或脑温的高低是影响缺血性脑损害程度的另一重要因素。

　　实验证明脑温降低3～4℃，即可明显地减轻缺血性脑损害。

　　反之，人为的增加脑的温度将加重缺血性脑损害。

　　在制作脑缺血模型时，动物的体温/脑温将受诸多因素的影响而发生改变。

　　例如麻醉可使代谢率减低、体温下降；

　　脑缺血本身可使脑组织代谢下降；

　　手术时切开头皮和打开颅骨，使脑的散热加快等都可使脑温降落，从而影响缺血损伤的程度。

　　因此，制作脑缺血模型时，应该监测脑温并设法维持在正常水平。精确的脑温监测是在硬膜下按置温敏电极，许多实验室常用监测直肠温度的方式配合加热垫和红外线灯泡照身来维护动物的体温在37.5℃左右。但应该注意在长时间的缺血期间（＞10分钟）直肠的温度不能直接反映脑温，通常要低2～3℃左右。

　　3. 麻醉对缺血性脑损害的影响

　　包括麻醉前的准备与处理、麻醉方法的选择、麻醉前给药、麻醉深度的判断、麻醉意外的急救等等。

　　麻醉剂对缺血模型脑损害的影响是通过影响细胞活动、代谢率、体温和血流来实现的。但各种麻醉剂对上述指标的影响是不同的，例如，halothane和barbiturate主要是抑制中枢神经系统的活动，而Ketamin和氟里昂有时将有中枢“兴奋”作用。barbiturate具有血管收缩作用，减少脑的基础血流。而halothane在低剂量时可扩张血管增加脑血流。由于在制作动物模型时不可避免的要使用麻醉剂，因此，实验者应该熟悉各种麻醉剂对各种生理、生化活动的影响，根据自己的实验需要选择麻醉剂，尽量地减少和控制麻醉对实验结果的负效应。

　　4．血液因素对脑缺血损害的影响

　　血液因素包括血压、血糖、血粘滞度、血CO2和O2张力。高血糖加重脑缺血损害已被许多实验室所报道，其机制尚不清楚，可能和加重缺血期的无氧酵解和乳酸堆积有关。因此在动物经受缺血手术前一般需禁食，并在缺血期和制作后监测其血糖水平。血CO2和O2分压对缺血后果的影响是直接的。此外动脉灌注压通过其对CBF的影响而对脑缺血后果发挥作用，通常脑灌注压在较广泛的范围内维持CBF相对恒定，但当动脉压下降到一定的程度时（人类50～60mmHg，鼠60～70mmHg），脑血流的自动调节能力将逐渐丧失。因此，监测血CO2、O2分压和动脉血压都是制作脑缺血动物模型的必要操作程序。

　　实验性脑缺血动物模型的制备是针对缺血性脑血管病提供一个强有力的研究对象，使我们从不同方面增加对缺血的认识。近年来有关脑缺血模型研究和应用的发展趋势是动物小型化（以大鼠或沙土鼠为主），强调缺血损伤的可控性和可重复性，同时严格控制各种干扰因素，尽量避免这些干扰因素对实验结果的影响。

　　二、严格控制实验条件和干扰因素

　　大量动物实验研究结果证实，实验条件和周围环境因素的改变对实验结果有明显的影响，如麻醉剂的选择、环境温度、动物血糖、血气及平均动脉压的控制等。如何在动物实验研究过程中严格控制实验条件？哪些实验条件必须得到控制？脑缺血活体研究过程中动物是否需要使用呼吸机？

　　1.合理选用麻醉剂:脑缺血动物模型均是建立在动物麻醉的基础上，这与人类脑血管病的发生情况不同，因此，需严格除外麻醉剂对实验结果的影响。目前，国内多采用动物一般状态下的水合氯醛、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠或乌拉坦麻醉。

　　而大量研究结果表明，全身麻醉剂可直接或间接影响脑血流、颅内压、脑代谢以及神经递质的传递。

　　以大鼠线栓法MCAO模型为例说明：

　　常规麻醉量的苯巴比妥钠、乌拉坦可使脑温明显下降；

　　水合氯醛、苯巴比妥钠可使大鼠呼吸频率下降50%，致使动物出现明显的酸中毒和二氧化碳潴留，其中戊巴比妥钠对大鼠生理指标影响*小。

　　人工辅助通气可使麻醉剂对大鼠生理指标的影响得到明显矫正。

　　目前，国际上脑缺血研究通用的麻醉方案是使用肌松弛药及人工辅助通气状态下的氟烷吸入麻醉，且术中连续监测心电图、血压及血气。整个过程接近人类的手术麻醉过程。

　　国内在脑缺血动物实验过程中以空气为气源，给予动物人工辅助通气，术中控制好呼吸频率及潮气量，采用戊巴比妥钠麻醉也能达到较为理想的效果。

　　在缺乏以上条件的实验室，我推荐使用2%戊巴比妥钠，45 mg/kg体重腹腔注射麻醉。实验中出现严重呼吸困难或有明显呼吸暂停的鼠要剔除不用。

　　2.控制实验环境温度、动物血糖、血氧及血气水平:

　　在实验的干扰因素中，尤以环境温度、动物血糖以及血气水平对脑功能的影响*为明显。

　　脑缺血动物模型制作过程中，脑温对实验动物的影响来源于两个方面，首先常规使用的麻醉剂可使脑实质温度明显下降，从而产生了亚低温脑保护作用；另一方面，如周围环境或手术局部温度过高，致使脑实质温度上升，对脑细胞产生明显的损伤作用。

　　因此，在脑缺血病理机制尤其是脑保护措施的研究过程中，应重视环境温度对实验结果的影响，尽量选用对脑温影响较小的麻醉剂，如戊巴比妥钠和水合氯醛，保持环境温度在25～30℃左右。

　　注意：实验鼠的肛温不能准确反映脑实质温度，有条件应直接监测深部脑实质温度。

　　局灶或全脑性脑缺血时动物血糖轻度升高，而高血糖本身可使脑梗死面积明显增加。为了控制动物血糖水平，可在实验前禁食12～24小时。

　　低氧血症、酸中毒对脑组织代谢尤其是脑血管的舒缩功能影响较大，而研究者研究的目的本身就是了解缺血、缺氧对神经元的损害机制，因此，脑缺血的基础研究对实验动物的血气、血氧以及血液酸碱度的要求就更为严格。

　　人工辅助通气是保证以上指标在正常生理范围内的*佳手段。

　　在开颅法制作脑缺血模型时或在线栓法等较为复杂的模型制作过程中，应考虑应用人工辅助通气。

　　光化学诱导皮层脑缺血模型或单纯颈动脉结扎再灌注模型，由于制作过程本身对动物生理指标影响较小，可不进行人工辅助呼吸。

　　总之，无论选用何种类型脑缺血模型，均要考虑到以上干扰因素对实验的影响，在总体实验开展之前要对选用的实验体系进行客观评估和调整。

　　三、规范化的实验方法

　　制作线栓法MCAO模型时，用不同规格的线栓、插入不同的深度，则脑梗死面积有明显的差异。

　　制作光化学MCAO动物模型的过程中，光照MCA的不同部位或光照不同的时间，脑梗死面积甚至模型的成功率有明显不同。

　　线栓法MCAO模型在实验技巧上要求较高，不同实验室应用该方法制备的模型在成功率、梗死体积、蛛网膜下腔出血（SAH）发生率及动物早期死亡等方面均有一定的差异。

　　国外有研究证实，以上差异是由于动物的品系和体重，尼龙线栓直径、强度、弹性及头端大小以及插入深度不同所造成。此外，该方法本身对大鼠月龄及体重的要求也非常严格。例如常用标准4-0的尼龙单线丝（ethilon和nitcho）只适用于体重280～350 g的大鼠，超出该范围的大鼠则不宜选用该模型或需重新建立实验方法及标准。

　　在脑缺血的研究过程中，研究者们为了模拟人类脑血管疾病的发病过程，往往期望选用老龄大鼠作为研究对象，但由于老龄大鼠的MCA发生了不同程度的迂曲、粥样硬化和管腔狭窄等解剖及病理上的改变，而且MCA管腔的粗细与常规线栓的规格不匹配，因此，不宜盲目选用老龄大鼠制作线栓法MCAO模型。

　　光化学诱导皮层脑梗死模型以制作方法简单、重复性好为其优势，但局部光照强度的稳定性以及光照局部温度却往往容易被忽略，后者如控制不好则可造成局部脑组织热损伤。因此，该模型不仅应采用冷光源，而且光源需要效果肯定的降温系统，以保证局部光照温度低于37℃。此外，*好每次模型制作前用光强度测定装置测定光源的强度，保持其恒定在0.56W/cm2左右。

　　四、展望

　　综观国内外的研究现状可以看出，目前脑血管疾病基础与临床研究又达到了一个前所未有的新高峰。缺血性神经元损伤与修复机制的研究已由整体水平发展到细胞、分子水平，由细胞外、核外相关事件的研究深入到核内事件发生的本质性研究。

　　随着神经科学的发展，脑缺血动物模型正在不断完善，对其标准化的概念也有了新的认识。为了适应形势发展的要求，我们在脑缺血基础研究过程中必须按照国际通用标准建立规范化的动物模型制作方案，结合国内现有的条件逐步完善动物实验条件，使我们脑缺血活体研究水平尽快与国际*水平接轨。*终目标是使一切影响因素得到有效的控制，使动物模型的建立*大程度地接近人类脑血管疾病的发病过程。

　　另外，为了克服动物实验研究可能发生的误差，我们应该强调每一个活体实验研究结论，尤其是突破性的研究结论都应该在相同以及不同动物模型上得到反复验证，这样才能使我们在脑缺血动物模型基础上所得到的研究结论达到真正意义上的严谨和可信。