动物造模,糖尿病,视网膜病变 中国实验动物信息网 2020-09-02 676

　　背景：视网膜病变仍然是糖尿病中*具破坏性的并发症之一。尽管在基础科学和临床研究方面已经取得了很大进展，以了解这种失明的复杂病理生理机制，但确切的机制仍是未知的，有效的治疗方法仍是未知的。糖尿病视网膜和毛细血管细胞可增加氧化应激并引起线粒体损伤。除毛细血管细胞外，还观察到其他视网膜细胞，包括感光细胞和视网膜色素上皮细胞，会增加氧化应激。抗氧化剂包括硫辛酸，可补充抗氧化剂并可以预防糖尿病大鼠的糖尿病性视网膜病变。除了氧化应激，视网膜还表现出许多与其他炎性疾病相一致的异常。

　　血管内皮生长因子（VEGF）是血管通透性和血管生成的重要血管生成因子。它在糖尿病和动物的视网膜和玻璃体中升高。这种增加与糖尿病性视网膜病症状有关。氧化还原敏感的核转录因子B和NF-κB被激活。这对于调节生长因子和细胞因子表达，炎性介质（如白介素-1β（IL-1β）和细胞粘附）以及增加的Molecular-1（ICAM-1）表达水平非常重要。动物模型显示，抑制糖尿病性视网膜病发展的抗氧化剂可以抑制视网膜NF-κB和IL-1β的增加。高含量的多不饱和脂肪酸与*高的氧气吸收和葡萄糖氧化的结合使视网膜比其他组织更容易受到氧化应激的影响。已经证明玉米黄质在糖尿病大鼠中的应用可以预防视网膜氧化应激并增加促炎细胞因子VEGF和ICAM-1、含有微量营养素的抗氧化剂如维生素C和维生素E，β-胡萝卜素和N-乙酰半胱氨酸可抑制糖尿病性视网膜病的发展。这项研究旨在调查营养补充对糖尿病性视网膜病变的影响。糖尿病视网膜病变动物模型用于研究多组分营养物对视网膜毛细血管细胞凋亡，毛细血管变性和细胞功能的影响。为了研究补品对线粒体功能障碍的改善作用，我们量化了炎症细胞因子的基因表达，编码细胞色素b和ND1的DNA以及VEGF，IL-1β，NF-κB的表达水平。方法：Wistar大鼠（雄性，200-225g）用链脲佐菌素诱导糖尿病，分为两组。大鼠组1（Purina 5001）中的几种饮食补品含有类胡萝卜素。 eyepromiseDVS经过特殊配制，可改善视网膜结构和功能，目前用于糖尿病患者视觉功能的临床试验。每公斤Purina饮食含维生素C营养（抗坏血酸300毫克），维生素D3（胆钙化醇，10000IU），维生素E（维生素E，300IU），鱼油ee 70％（1.6g），EPA（二十碳）五烯酸（650毫克），DHA（二十二碳六烯酸，500毫克），苯丙胺（1克），α硫辛酸（750毫克），comcomin（200毫克），玉米黄质（40毫克），叶黄素（20毫克）获得专利的配方包含300种白藜芦醇，绿茶，姜黄，N-乙酰半胱氨酸，松树皮，葡萄籽提取物，辅酶Q10锌（2.65克）和豆油。第二组大鼠接受不补充嘌呤饮食（DIAB），并使用与对照组年龄相同的正常大鼠。在整个研究期间（11个月），糖尿病大鼠的平均每日食物消耗为50克。从实验开始11个月后，通过二氧化碳窒息法杀死大鼠。将一只眼睛悬浮在10％福尔马林中，用胰蛋白酶消化以制备视网膜微血管，并移开另一只眼睛的视网膜以定量常规生化参数。取出一部分肝脏，并通过HPLC检查某些主要成分的吸收。视网膜毛细血管细胞凋亡和组织病理学：将视网膜与福尔马林固定的眼睛分开，并用水冲洗过夜。要分离毛细管，请在37°C下用3％的含有200 mM氟化钠的粗胰蛋白酶消化视网膜45-70分钟。末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TDT）介导的dUTP缺口末端标记染色（TUNEL方法）用于检测凋亡的血管细胞。在TUNEL反应开始之前，将视网膜血管暴露于DNase作为阳性对照。通过TUNEL染色对高碘酸盐Schiff和苏木精染色的血管和组织学评估。计算视网膜中央区域中的无细胞毛细血管的数目，并将其表示为视网膜中的无细胞毛细血管。功能分析：通过测量视网膜电图（ERG）来测量4个月时糖尿病大鼠的视网膜功能。使大鼠适应漆黑的夜晚，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，并用1％托吡卡胺和2.5％盐酸去氧肾上腺素扩张。将大鼠放在加热台上，并用直肠温度计监测体温。将螺纹电极的银眼放在角膜表面的1％甲基纤维素薄层中，并测量A和b波幅度。放置在尾巴和脸颊上的针状电极分别充当接地电极和参比电极。通过2,7'-dichlorodiacetate的荧光光谱法测定活性氧（ROS）。将蛋白质（5-10μg）在含有2uMDCHFDA的PBS中孵育10分钟。在485nm和530nm的波长下测量荧光。确定视网膜的抗氧化能力。线粒体基因组特异性PCR定量延伸长度和03XL PCR试剂盒确定线粒体DNA损伤的程度。 ELISA法定量检测VEGF，NF-κB和IL-1β的表达。

　　结果：含类胡萝卜素的膳食补充剂可预防糖尿病性视网膜病变加速毛细血管凋亡和组织病理学：正如预期的那样，在11个月大的糖尿病大鼠中视网膜血管TUNEL阳性细胞显示出3-4个毛细血管的增加和变性。含有类胡萝卜素的膳食补充剂可以改善糖尿病引起的毛细血管凋亡，正常喂养大鼠的TUNEL阳性毛细血管细胞数量与糖尿病大鼠相似。与未使用膳食补充剂的大鼠相比，在使用膳食补充剂治疗的糖尿病大鼠中，视网膜血管中退化的毛细血管数量明显减少。通过ERG测量评估视网膜功能。图2显示，在糖尿病大鼠中，A波和B波幅度显着降低，而视网膜电图响应被延迟。 A波和B波振幅的减小是由于人们接受了补充营养的饮食。喂养的糖尿病大鼠视网膜氧化应激和线粒体损伤增加：与正常年龄匹配的大鼠相比，糖尿病大鼠视网膜和总抗氧化剂中的ROS水平显着增加能值已大大降低。但是，与没有糖尿病的糖尿病大鼠相比，接受补充剂的糖尿病大鼠的ROS水平明显降低，抗氧化能力增强。与未接受膳食补充剂的糖尿病大鼠相比，接受膳食补充剂的糖尿病大鼠还预防了线粒体损伤并显着提高了线粒体DNA的基因表达，该基因编码电子传输链中的蛋白质。与正常大鼠相比，糖尿病大鼠视网膜中ND1、ND6和Cytb的水平降低了约40-80％。用膳食补充剂治疗的糖尿病大鼠阻止了这种下降。使用营养补充剂可以保护视网膜免于增加炎症介质。与正常大鼠相比，糖尿病大鼠的视网膜血管内皮生长因子水平增加了50％，并且通过营养补充改善了视网膜血管内皮生长因子的增加。因为炎症被认为是糖尿病性视网膜病的主要原因。 补充营养不能改善糖尿病大鼠的高血糖严重程度：与未补充营养的糖尿病大鼠相比，接受补充营养的大鼠肝脏样品中大量营养成分的分析然后，α-生育酚水平增加2（36μg/ g?74μg/ g），叶黄素增加3倍（0.02μg?0.06μg），玉米黄质增加9倍（0.008μg?0.07μg/ g）的时间。 ..

　　结论：我们的数据表明，营养补充剂可维持长期糖尿病患者视网膜的结构和功能，同时保护神经细胞和血管细胞，并抑制视网膜病变的发展。它可以通过改善炎症介质的增加并维持线粒体的稳态来实现，从而自我保护视网膜免受线粒体损害的恶性循环。