动物造模,药效评价,诱发溃疡性结肠炎 z-bio 2024-08-21 216

　　(1)复制方法  成年SD大鼠，5～6个月龄，体重为250～400g，将14～16d龄的同系胎鼠结肠3～4cm植入在其右肾包膜下。术后第7，14和21天时，抽取心脏血液5～10ml，用于心脏血淋巴细胞(HBL)的分离，同时取出宿主结肠及胎鼠结肠，部分进行脱水、包埋和切成6μm厚的病理切片，HE染色后供光学显微镜观察，部分用于结肠黏膜淋巴细胞(CML)结肠上皮细胞(CEC)分离。在此基础上，对宿主鼠HBL和CML对CEC的细胞毒活性进行测定。HBL、 CML和CEC分离方法：用Ficoll-Hypaque梯度分离法分离肝素化的心脏血单个核细胞，用玻璃黏附法去掉单核细胞和巨噬细胞，用TcA溶液(199Tc，用10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素等构成)将淋巴细胞浓度调整到1×1000000/ml，成活细胞在95％以上，用Keoder的方法分离 CEC，后者浓度调节到1×1000000000/ml，成活上皮细胞在89％以上。细胞毒测定方法：微测定板内加入浓度为1×100000/ml的 CEC(靶细胞)150μl/孔，于37℃、5％CO2和95％O2的环境下培养12h。去上清液后，加入HBL和CML(效应细胞)150μl/孔，效应细胞对靶细胞的比例为100：1。自发去掉的靶细胞孔只加TcA培养液，最大去除的靶细胞孔加入双蒸水，将所有的样品做成3份，总培养体积为0.3ml，pH值调到7.2，在37℃下继续培养12h，最后用Hank溶液去掉未黏附在微测定板壁上的CEC，留下黏附在壁上的CEC，在相差显微镜下计数，按下式计算细胞毒指数。细胞毒指数(％)＝[(实验去掉的靶细胞－自发去掉的靶细胞)/(最大去掉的靶细胞－自发去掉的靶细胞)]×100％。

　　(2)模型特点  术后7d，动物胎结肠开始有炎症细胞浸润，一些黏膜腺体和上皮细胞脱落，黏膜变薄。移植物肠腔内有大量的黏液，它压迫组织并导致囊腔形成。14d时，上述变化更加严重，所有的黏膜都受到破坏，腺体数量减少，肠腔内有大量的坏死物质，淋巴细胞和单核细胞浸润从黏膜肌层扩展到浆膜层。21d时，黏膜腺体严重萎缩变性，有纤维结缔组织增生。体外细胞毒测定显示，模型动物的HBL和 MCL的细胞毒活性指数明显高于正常对照鼠。

　　(3)比较医学  植入的胎鼠结肠对成年同系鼠是一种免疫原，可引起宿主鼠的一系列免疫反应。本模型显示，胎鼠结肠植入成年同系鼠肾包膜下，前者黏膜坏死脱落，炎症细胞浸润，呈现典型的宿主抗移植物反应；同时，宿主鼠的结肠固有层也有炎症细胞浸润，其病理特征是淋巴样滤泡，有时黏膜出现糜烂和溃疡。宿主鼠的血清中存在抗植入胎鼠结肠的阳性抗体，同时在血清中也有抗自身结肠的阳性抗体，显示在宿主结肠和植入胎鼠结肠之间存在着交叉抗原。体外细胞毒测定显示，宿主鼠心脏血淋巴细胞(HBL)和结肠黏膜淋巴细胞(CML)对自身结肠上皮细胞(CEC)的细胞毒活性显著升高，表明抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)在本模型的复制过程中起了重要的作用，提示溃疡性结肠炎的细胞毒过程还需要抗体或免疫复合物的介导。鉴于上述特点，本模型作为探讨溃疡性结肠炎病因与发病机理的一种实验手段，在医学基础研究领域具有较好的应用价值。但是，由于胎鼠结肠移植术是该模型的核心技术，所以技术要求较高，实验周期较长，成功率亦相对较低。