动物造模,药效评价,莱姆病 z-bio 2024-08-19 179

　　1.造模方法 选取无其他病原体感染的狗，年龄在6～8周大小，每只动物分别有独立的房间，用商品化的饲料喂养，无菌饮用水。把小狗暴露在含有携带伯氏疏螺旋体的全沟硬蜱环境中，其中全沟硬蜱来自我国莱姆病高发地区，经过实验室检查其身上携带有病原体，在应用于实验前饲养在10℃、湿度为94％的环境中。剪去实验动物左胸部的毛发，把携带病原体的硬蜱放到该部位，使其身体通过叮咬宿主完全充血并于第7天移走。为确保实验动物完全被感染，于14d继续重复上述实验。每天进行临床体征的检测，检测小狗的体温、体重等，有无受影响的肢体，有无肿胀等。在硬蜱叮咬实验动物狗后，仅有少数模型动物出现体温升高到39.4℃以上持续1d，偶尔有体温升高持续2d。莱姆病感染后的狗可以出现四肢或一个肢体跛行，此临床表现在没有经过任何药物治疗的情况下可以持续3～5d。在模型动物感染后大约71d时出现跛行，主要是在靠近蜱叮咬部位的动物左前腿易出现关节炎症状。随着感染时间延长，实验模型的四肢均可见跛行现象，且每2～14d发作一次。

　　2.模型检测方法

　　(1)血清学检测：初次感染2周后取模型的血清样本进行抗伯氏疏螺旋体抗体检测。采用计算机控制的动态酶联免疫吸附技术测试。所有动物模型的血清一起检测，避免实验结果偏倚误差。在用伯氏疏螺旋体感染实验狗后的90d内，体内抗病毒螺旋体的效价明显增高现象，此后抗体效价只表现出轻微增高。

　　(2)病原分离培养：造模4周后，对动物模型实施安乐死，收集皮肤、心脏等25个部位的组织，为避免交叉感染每只动物模型用一套手术器械。收集的组织包括叮咬部位附近的皮肤组织，含滑膜6个部位的组织(肩、肘、膝)，前肢肌肉和筋膜(三头肌、前肢筋膜)，颈部皮肤，腋窝皮肤，淋巴结，心包膜等。把取得的上述组织0.5g放到9ml BSK培养基培养，5周后显微镜下可以检测到活体B.burgdorferi螺旋体。把模型叮咬部位的皮肤和淋巴结放到BSK培养基，32℃培养，5周后显微镜下可以检测到活体B.burgdorferi螺旋体。

　　(3)聚合酶链反应(PCR)检测：PCR可以用来检测动物血液和组织中伯氏疏螺旋体特异性DNA片段。用此法可以检测血、皮肤、组织和脑脊液中的伯氏疏螺旋体DNA。模型狗的皮肤样本培养和PCR结果显示伯氏疏螺旋体感染阳性。

　　(4)组织病理学检测：对感染505～600d的实验模型狗实施安乐死，四肢关联的组织(膝盖、踝关节和趾骨)放入含有10％的福尔马林溶液，并进行脱水、包埋、切片。对组织片子进行标准的苏木素伊红染色，倒置光学显微镜下观察到模型动物的关节呈不同程度的滑膜增厚、增生性滑膜炎表现，滑膜下方可见单核细胞浸润；在关节附近血管周围可见单核细胞。

　　(5)关节滑液和脑脊液检测：在对实验动物实施安乐死后，尸体检查时取狗肢体关节部位的关节液3ml，并用生理盐水1：10稀释，用血细胞计数器计数细胞总量。经皮穿刺实验模型狗的脑脊液大约3ml，进行细胞计数及分类。

　　3.模型特点  由于狗与人类关系密切，感染蜱可以通过狗传播给人，是蜱类叮咬感染的主要对象之一。狗莱姆病感染动物模型易出现典型的急性、复发性跛行，并伴有关节脓性关节炎，可发展为慢性关节炎，严重时出现瘸腿等表现。此模型易于研究莱姆病感染关节炎病变的机制、表现、药物治疗等相关研究。