动物实验,早产小鼠视网膜病变 中国实验动物信息网 2020-08-26 633

　　目的：为了确定溴莫尼定（BRI）是否能慢性治疗新生小鼠高氧暴露后（早产儿视网膜病变（ROP）小鼠模型）的视网膜血管渗漏和新生血管及激光治疗后大鼠脉络膜新生血管（CNV）。

　　方法：激光治疗能诱导BN大鼠实验性CNV，BRI或赋形剂(VEH)通过渗透微泵给药，激光治疗后11天测量CNV形成。新生小鼠出生后第7-12天通过暴露于75%氧诱导新生小鼠视网膜病变。通过灌胃法给予BRI或VEH，在第17天，测定玻璃体视网膜血管内皮细胞生长因子（VEGF）的浓度，视网膜血管渗漏，新生血管和血管闭塞。通过兔视网膜下注射脂多糖/成纤维细胞生长因子-2诱导实验性CNV。

　　结果：全身BRI治疗显著衰减BN大鼠前3天形成的CNV或激光治疗1小时的CNV。第17天时，BRI启动治疗显著降低高氧暴露诱导小鼠视网膜病变玻璃体视网膜VEGF浓度，视网膜血管渗漏和视网膜新生血管。BRI玻璃体腔内治疗对兔缺血性脉络膜新生血管的形成没有影响。

　　结论：BRI治疗显著降低ROP和CNV动物模型的玻璃体视网膜VEGF浓度，视网膜血管渗漏，视网膜脉络膜新生血管。BRI可抑制缺血导致的玻璃体视网膜VEGF表达，从而减少血管渗漏和视网膜脉络膜新生血管。

　　背景：缺血时是诱导眼部疾病相关视网膜新生血管病变的主要原因，包括早产儿视网膜病变（ROP）和增殖糖尿病视网膜病变（PDR）。ROP2正常生长发育过程中或PDR3局部毛细血管丢失产生的血管闭塞和停止脉管系统导致的视网膜缺血的导致视网膜表面异常血管增殖。在ROP，新生血管经常衰退，如果血管导致视网膜剥离或者血管渗漏导致疤痕可以导致不可逆转的视力丧失。缺血可能导致脉络膜新生血管（CNV），发生在湿性（渗出性或新生血管性）与年龄相关的黄斑变性（AMD）。湿性AMD，脆弱，血管渗漏，从脉络膜通过Bruch膜成长到视网膜色素上皮细胞（RPE）和在RPE上或视网膜下间隙增殖。湿性AMD，与CNV相关的血管渗漏，出血，可以迅速导致严重的视力丧失。缺氧上调血管内皮生长因子（VEGF），在缺血性视网膜病变中对刺激视网膜新生血管形成起主要作用。证实，PDR患者玻璃体血管内皮生长因子浓度升高。此外，使用抗血管内皮生长因子药物治疗已被证明降低动物模型患者视网膜新生血管与PDR以及增殖性缺血性视网膜病变。在充分研究的ROP新生小鼠动物模型，从出生（P）7到 P12，暴露于75%氧和然后返回到房间（含正常的氧浓度）发展为氧诱导的视网膜病变（OIR），特征是高氧暴露期间中央视网膜缺血，其次是交界处的新生血管。在P17 到P21新生血管形成新生血管丛伸入玻璃体达到*大。

　　在湿性AMD，VEGF也是CNV的重要介质。手术切除湿性AMD患者CNV组织，通过免疫组化法定位血管内皮生长因子。玻璃体内注射抗VEGF药物用于临床治疗湿性AMD。在动物模型中，激光光凝脉络视网膜与破坏玻璃膜能可靠地产生CNV。激光诱导实验大鼠CNV模型的实验研究：增加视网膜色素上皮和脉络膜细胞血管内皮生长因子的基因表达。激酶抑制剂抑制血管内皮生长因子受体信号转导的研究已被证明几乎完全消除激光诱导CNV动物模型的CNV。

　　方法：大鼠CNV实验模型：雄性BN鼠，体重250-300g。动物正常饮食，实验前至少驯化一周。驯化后，大鼠称重，划为治疗组，该组体重分布均匀. 大鼠麻醉用1:1的盐酸氯胺酮注射液（65mg/ml）和甲苯噻嗪（11 mg/ml）混合液肌注1ml／kg， 用1%托吡卡胺和10%盐酸去氧肾上腺素扩大瞳孔。实验采用激光诱导CNV，使用氩离子激光在每只眼睛视盘周围灼烧3-4个激光点。每个光凝使用波长为514纳米（绿色），光斑尺寸为100微米，功率为110兆瓦，和曝光时间为100毫秒。

　　CNV药物治疗和评估：激光诱导前3天全身给予BRI或赋形剂，激光诱导后不同时间。通过渗透泵，连续皮下给予BRI（1mg/kg/d）或赋形剂（蒸馏水）。激光处理后11天，动物通过CO2窒息法处死，，按照以前所描述的方法测定CNV形成。眼球固定于4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲生理盐水（PBS；9 g/L NaCl，0.232 g/L磷酸二氢钾和0.703 g/L磷酸氢二钠[ pH7.3 ]）1小时。眼前段，晶状体和视网膜被剔除，剩余部分在4°C用PBS缓冲液冲洗（含0.5%牛血清白蛋白，0%吐温20，和0.05%的叠氮化钠），在4°C同1:100的稀释1mg/ml凝集素IB4溶液共孵育4h。孵育后，用ICC缓冲液冲洗。

　　兔CNV动物模型：实验选用24只，6-7月龄，体重2-2.5kg荷兰兔。通过肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）和甲苯噻嗪（5mg/kg）麻醉动物后内眼手术诱导CNV。每只动物的一只眼睛用作研究。内眼手术前外用1%托和2.5%盐酸苯肾上腺素扩瞳，进行眼底和荧光素血管造影检查。通过视网膜下注射50L中含100ng重组人类生长因子的血管生成剂和100ng脂多糖诱导CNV。注射用一个30号针头穿过视网膜，损伤的玻璃膜范围可视。六只兔子视网膜下注射赋形剂，但没有损伤玻璃膜作为对照组。操作后外用局部散瞳药膏（1%阿托品）和抗生素软膏（杆菌肽/新霉素/多粘菌素）以防止炎症相关的虹膜粘连等并发症。

　　CNV药物治疗和评估：视网膜下注射FGF-2 / LPS1小时，3天，7天和 10天，给兔眼玻璃体腔注射BRI或赋形剂。在视网膜下注射后14天，进行眼睛检查，用眼底相机拍摄记录玻璃体，视网膜，脉络膜和血管的变化。静脉注射0.2ml 5%荧光素-葡聚糖和0.25ml 10%荧光素钠评估脉络膜新生血管形成和血管渗漏。由数字图像定量分析CNV病灶区。

　　实验性氧诱导视网膜病变小鼠模型: 使用Smith 等人报道的C57B6小鼠诱导OIR，新生小鼠P7-P12被放置在75%氧盒中，盒中有满足5天的充足的食物和水，仅给药时允许打开盒。在P12天，小鼠回归正常的氧含量。P10 P12和P16开始灌胃每日一次给药溶于水的BRI或赋形剂（水）。动物暴露于室内空气后5天，评价视网膜新生血管形成和血管渗漏。

　　视网膜血管造影与量化：如前所述，通过血管造影评价OIR小鼠视网膜新生血管形成和血管闭塞。P17小鼠深度麻醉，通过左心室灌注含有50mg 1ml荧光素右旋糖酐PBS缓冲液。摘除眼球4%多聚甲醛固定24小时。去除晶状体后，视网膜被剥离和包埋。量化血管闭塞和视网膜新生血管。在4倍的荧光显微镜下观察视网膜整体图像。新生血管面积和无血管面积表示为整个视网膜面积的百分比。

　　免疫印迹分析：玻璃体视网膜VEGF表达及蛋白免疫印迹分析确定了泄漏。在P17，动物二氧化碳窒息法处死，分离视网膜和玻璃体组织和在4°C裂解缓冲液超声均质(5mM HEPES [pH 7.5], 50 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.25% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS, and 1 mM EDTA)。在4°C通过离心分离不溶性颗粒和使用蛋白质检测试剂盒测定上清液的蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白，并电转移至PVDF膜上。膜用1:1000多克隆山羊抗白蛋白抗体，1:1000单克隆鼠抗肌动蛋白抗体和1:500多克隆兔抗VEGF抗体孵育，并用抗山羊、抗小鼠和抗兔IgG相关的过氧化酶作为二抗。免疫反应性条带通过化学发光法检测。α-肌动蛋白信号的强度被用作内源对照。

　　结果：BRI对激光诱导BN大鼠CNV形成的影响：为确定BRI对动物模型CNV形成的影响。通过激光处理BN大鼠两眼诱导CNV。刺激CNV形成11天后，1mg/kg/d BRI连续的全身治疗显著降低CNV病灶区。在激光诱导前三天开始使用BRI治疗动物的CNV区域为11919+1128平方微米，而赋形剂治疗组为19185+1522平方微米。激光处理1h后开始治疗，CNV区域为10382+864平方微米，赋形剂处理组为17101 +1407平方微米。

　　BRI对激光诱导BN大鼠CNV治疗的时间依赖性：确定BRI治疗对激光诱导BN大鼠CNV形成影响的时间依赖关系，在激光处理后1h，1d，3d或5d，BRI（1mg/kg/d）或赋形剂通过渗透微泵全身治疗。1mg/kg/d BRI，在激光诱导1h内全身治疗能显著降低CNV病灶。当激光诱导1d或更长时间使用BRI全身治疗同赋形剂处理组无明显差异。

　　BRI对小鼠动物模型视网膜血管渗漏的影响：在P17，通过视网膜/玻璃体中的白蛋白浓度的免疫印迹分析测定视网膜血管渗漏。BRI治疗的OIR小鼠玻璃体视网膜蛋白-肌动蛋白比为1.32+0.10，赋形剂处理的OIR小鼠视网膜蛋白-肌动蛋白比为2.09+0.12.对照组，未暴露高氧的OIR小鼠视网膜蛋白-肌动蛋白比为1.23+0.11,表明，从P10-P16，用BRI治疗减少由小鼠之前暴露于高氧引起的约90%视网膜血管渗漏。

　　BRI对小鼠OIR动物模型视网膜血管闭塞和新生血管影响：确定BRI对OIR小鼠视网膜新生血管形成的影响，新生小鼠P7-P12放置在75%氧和P12-P17放置在室内空气。从P10-P16BRI（3 mg/kg）或赋形剂每日灌胃一次. 在P17，用高分子量荧光素葡聚糖灌胃。通过血管造影测定视网膜新生血管。从P10-P16每日给予BRI治疗能减少视网膜新生血管。BRI治疗组小鼠视网膜新生血管的面积为5.83%（+0.81%），而赋形剂处理组为10.80%(+0.71%)。对照组没有暴露于高氧环境的小鼠没有出现视网膜新生血管。视网膜血管闭塞用来评价确定BRI治疗对OIR小鼠缺血性损伤程度的影响。

　　溴莫尼定对小鼠模型视网膜新生血管形成剂量和时间依赖性的影响：P17，用高分子量荧光素-葡聚糖通过血管造影来确定视网膜新生血管。BRI治疗对视网膜新生血管的影响呈剂量依赖性。从P10-P16,BRI每日剂量分别为1,2,3mg/kg，BRI对视网膜新生血管的治疗也有时间依赖性。每日治疗能有效减少视网膜新生血管。当从P12-16给予3mg/kg BRI对视网膜新生血管没有影响。

　　溴莫尼定对小鼠动物模型玻璃体视网膜VEGF浓度的影响：VEGF分子量大约为42Kda。P10-P16,每日给予BRI能有效阻止玻璃体视网膜VEGF浓度的增加。确定BRI治疗对非缺血性CNV动物模型的影响，通过眼底荧光血管造影评估诱导14 d后角膜新生血管。诱导CNV 14天后，玻璃体腔重复给予10或100 g BRI对CNV病变区无明显影响。10ug BRI治疗动物的CNV区域为15.8+2.7平方毫米，100ug BRI治疗动物的CNV区域为16.7+4.6平方毫米，赋形剂治疗动物的CNV区域为14.8+2.5平方毫米。

　　结论：这项研究表明，BRI治疗能显著降低新生小鼠视网膜新生血管的形成，早产儿视网膜病变，并显著降低激光诱导玻璃膜破裂大鼠的CNV。BRI治疗视网膜和脉络膜新生血管效果呈时间依赖性，只有当治疗在心肌缺血时发生，血管内皮生长因子刺激是在这种情况下新生血管生成的主要因素。这些结果表明，BRI可用于治疗与视网膜和脉络膜新生血管相关的疾病。