动物造模-,药效评价,遗传性白内障 z-bio 2024-08-07 105

　　临床上将出生后即存在或出生后才逐渐形成的晶状体部分或全部混浊称为先天性白内障。它是造成儿童失明和弱视的主要原因，先天性白内障是由于胚胎期晶状体代谢异常而导致自身透明度下降的疾病。诸多因素可导致胎儿先天性白内障的发生，这种白内障的基因位点和病因学机制是多种多样的。

　　1．小鼠  Nakano小鼠是第1个用于遗传性白内障动物模型的动物，被广泛应用于生物化学的研究。最早由Nakano等在1961年报道，Iwata和Kinoshitaz在1971开始研究，之后Kinoshitaz实验室对Nakano鼠模型进行了近10年的研究，他们是最早系统尝试确定遗传性白内障的发病机制的学者，此后NakanO鼠一直是遗传性白内障动物模型的动物。这种鼠由Iwata博士引进哈佛大学Kinoshitaz实验室，与正常的Charkes River的小鼠进行杂交，遗传方式为常染色体隐性遗传。白内障最早出现在生后的第4周，刚开始呈针尖样混浊，最后整个晶状体混浊。混浊伴有显著的形态学改变和蛋白合成抑制，生后6d去核作用受损，伴随晶状体核周区纤维末梢肿胀，受累晶状体纤维的细胞质包含颗粒状物质和许多微细胞器。体外研究表明，在15d时，细胞延长、聚集和透明小体形成。电镜显示这些透明小体由未成熟的晶状体细胞组成，细胞质内出现许多大的空泡。免疫荧光研究表明这些透明小体呈α-晶状体蛋白阳性。生物化学研究表明呈渗透性白内障，2周后晶状体增长减缓，伴随钙泵缺陷，纤维末梢肿胀。在生后大约20d时，如果快速增加钠浓度可以产生白内障，它是Na+-K-ATP酶活性缺陷引起的，认为与白内障的开始有关。Philly小鼠来源于Swiss-Webster鼠系，首先由Kador。等在1980年报道，生后15d时裂隙灯检查可见晶状体缝周围出现轻微的混浊，此后逐渐加重；到30d时核周围出现明显混浊；35d时明显加重；45d时核出现浓密混浊及前囊下混浊。这种白内障是一种渗透性白内障，表现为水合作用增强，钠钙浓度增加，运输系统在混浊出现之前不受累，但是在15～20d时，由于膜通透性的增加，引起钠积累降低。说明膜渗透性的增强是导致渗透性白内障的致命缺陷。晶状体中的蛋白代谢在第3周和第8周明显发生改变，伴有β和γ-晶状体蛋白的明显减少，这是由于蛋白水解作用增加和与α-晶状体蛋白合成有关的蛋白合成降低。这种合成降低与晶状体内离子浓度发生变化有关，并且发现β-晶状体蛋白的一种抗原成分缺失。Fraser小鼠白内障是一种出生前就发生的显性白内障，1962年由Fraser和Schantach首先报道，由一种叫作shrivelled的突变基因引起，这种鼠品系现在称为Fraser小鼠，或CATFR小鼠。怀孕10d就能发现病理变化，异常的有丝分裂引起晶状体核上皮的多层和纤维细胞的明显变性。有人报道这种白内障晶状体缺乏βH-晶状体蛋白凝聚，降低γ-晶状体蛋白多肽浓度，增加了蛋白的水解作用。Muggleton-Harris等1987年报道，Fraser白内障的基因位于10号染色体，而且这种基因与Lyon等1981年报道的(LOP)晶状体混浊基因紧密连锁。由于这种白内障的表现型与Fraser混浊极为相似，所以Fraser基因和LOP基因被认为很可能是一对等位基因。SAM鼠最早由Takeda等1981报道。Hosokawa研究发现，SAM-P3品系发病率最高，1岁时有27.5％患有白内障，16个月时有70.6％患有白内障，白内障通常是单眼。1988年Hosokawa培育出SAM-R／3品系，这种鼠白内障大约10周就可发生，20周时发病率为50％，1岁时雌鼠白内障的发病率高达90％，雄鼠发病率为保持在50％～60％，大多数动物最后形成双眼白内障，混浊开始时在后极部呈云雾状，以后核的后表面和皮质区逐渐增强，成熟时出现后极突起，核脱位。成熟期白内障与同龄的正常白内障相比水增加10％～20％，蛋白降低50％。

　　2．大鼠  白洁等选取成年发情期雌性Wistar大鼠24只，体质量200～220g；雄性Wistar大鼠16只，体重260～280g。随机抽取雄性大鼠4只，雌性大鼠6只，雌雄比为3:2同笼饲养在普通级饲养室。第2天8时观察母鼠，将阴道内发现阴栓或显微镜下发现精子者标记为怀孕0天，以后顺延，记录受孕日期。受孕后雌鼠随机分为对照组(A组)和3个实验组，即阻断子宫血流5min(B组)，10min(C组)，20min(D组)。每次随机选取6只实验组大鼠，实验组A、B、C分别用止血钳钳夹双侧子宫动脉5min、10min和20min后恢复血流。将各组存活小鼠于出生25d后处死，取出晶状体，于室温下立即放入戊二醛中固定，每天更换新鲜的固定液。3d后取出标本用磷酸缓冲液冲洗3次，每次10min，于显微镜下沿赤道部切取横截面为1mm2柱状晶状体结构作为透射电镜标本。由于妊娠中晚期的大鼠不易发生流产，选择在妊娠第19天实施手术为研究阻断子宫血供的最佳时间。通过对手术中情况、死胎率及晶状体透射电镜观察进行对照，结果表明阻断子宫动脉10min可以成功建立胎鼠先天性白内障模型。与阻断血流20min相比，其手术时间短，所需麻醉药量相对较少，术后苏醒时间短，相对减少了麻醉药对孕鼠及其胎仔的影响。另外，本实验方法操作简单，费用低，可行性高，胎鼠宫内缺氧时间易于掌握，重复性好，为制备先天性白内障动物模型及探讨人类先天性白内障的发生、发展提供了新的实验方法。ICR大鼠白内障首先由Ihara于1983年报道，大约2个月时由于晶状体纤维的肿胀，在晶状体的前囊下出现轻微的弥漫性混浊。3个月后后极部出现浓密的混浊，很快累及整个晶状体皮质及核的表层，到4个月时核的中心区域也出现混浊，仅前表面和赤道区皮质透明。3个月后后部皮质和核的纤维细胞出现明显的肿胀和变性，呈常染色体隐性遗传，血清脂质过氧化物增加，13个月时达到高峰。电镜显示后囊下晶状体出现空泡，晶状体出现混浊之前有异常的氧化应激发生。Ihara使用裂隙灯显微镜及组织学方法对ICR大鼠进行研究，裂隙灯检查表明这种大鼠在1个月时晶状体完全透明；2个月时在后囊下特别是缝合线周围出现轻微的弥漫性混浊，其余部分保持正常透明；在3个月之后，后极部出现浓密混浊，这种混浊很快扩展到整个皮质和后部的核下区，然后到前部的核周区，最后整个核混浊。大约4个月时，除了前下和赤道区皮质外，晶状体其余部分出现完全混浊。组织学检查，1个月时，皮质的晶状体纤维(除了赤道区)呈纺锤形或球形肿胀，未见晶状体上皮细胞的增殖和局限性纤维坏死。2个月时核内出现大量肿胀的纤维，变性非常明显，核纤维解离萎缩融合崩解及弥漫性肿胀，最后出现许多大小不一的结构，提示出现液化作用。完全成熟后在核的前部出现钙沉着。Emory大鼠1982年首先被kuck报道，由Carworth Form-Webster品种培育而来，晶状体典型改变发生在5～6个月，白内障呈常染色体显性遗传，白内障的发病年龄、发病率和形态学变化有很大的差异性。白内障的形成早期有GSH和SH-蛋白的降低，晚期有脂质超氧化物增加，说明有氧化应激反应发生。

　　3．犬  与啮齿类相比，犬的晶状体／眼球比最接近于人类，这可能是使用狗作为白内障动物模型的最重要的原因。遗传性白内障要么是先天性的要么是生后的，晶状体可以是一部分受累也可以全部混浊，但最后白内障的结果是相似的。小型髯犬的白内障出现在睁眼后2周，混浊主要出现在晶状体核和后皮质并伴有小眼畸形。前部和赤道部皮质空泡和水隙主要出现在4～6月。1～3岁时白内障成熟。这种白内障的晶状体降低了游离的GSH水平而增加了蛋白型-GSH水平。

　　4．豚鼠(荷兰猪)13／N  由Stone和Amsbaugh于1984年首先报道，出生时即出现核型白内障，这种白内障由单个常染色体显性基因传送，伴随zeta-晶状体蛋白浓度缺失或降级，这种蛋白是一种分类特异性晶状体蛋白，出现在豚鼠晶状体中。在白内障动物中与zeta-晶状体蛋白密切相关的一种新的蛋白被合成，这种蛋白似乎是zeta-晶状体蛋白基因变异的产物。