动物造模,药效评价,病毒性角膜炎 z-bio 2024-08-02 108

　　【造模机制】病毒性角膜炎以单纯疱疹病毒性角膜炎最为多见。HSK是一种由单纯疱疹病毒感染所致的严重危害患者视功能的致盲性眼病，其临床特点主要表现为病程长、反复发作，最终导致角膜白斑、角膜新生血管增生、角膜溃疡甚至穿孔等严重危害患者的视功能。关于HSK的临床基础研究，目前主要是通过建立HSK动物模型来进行。造模方法主要有角膜划痕接种和紫外线B光照射方法。

　　【造模方法】选用健康BALB/c小鼠，雌雄不限，体重18～20g，双眼无结膜炎、角膜炎等眼部疾病。Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)，使用前滴度为2×1000000pfu/ml。给予小鼠双眼点滴2.5g/L氯霉素滴眼液，2次/天，1周后进行接种。接种病毒前用10g/L荧光素钠对小鼠角膜进行染色，并在裂隙灯显微镜下检查角膜情况，排除存在角膜或结膜病变者。水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，显微镜下用5号手术刀片背面尖端于右眼角膜呈“#”字划痕，以穿透角膜上皮层为宜，再用吸管将5μl含2×1000000pfu HSV-1病毒的DMEM滴于右眼角膜表面，闭合眼睑后轻轻按摩30秒，以使病毒液充分接触角膜。造模后次日，继续给予2.5g/L氯霉素滴眼液，2次/天，连续2周。并于次日开始连续3天，每天用10g/L荧光素钠染色后在裂隙灯显微镜下检查角膜情况，同时用棉拭子取右眼角膜表面泪液进行人胚肾上皮细胞(HEK293T)检测以确定有无病毒复制。

　　对上述造模动物，右眼在2.5g/L氯霉素滴眼的基础上，增加1g/L阿昔洛韦滴眼液，2次/天，连续2周，以促进HSK模型小鼠的急性上皮性角膜炎愈合，并使病毒在三叉神经节或角膜内建立潜伏感染，建立HSK潜伏感染模型。

　　取病毒接种后7周并经角膜和三叉神经节样本PCR检测证实为HSK潜伏感染期小鼠模型，将其右眼表面麻醉后，暴露在波长为302nm的紫外线下照射3分钟。紫外线透照仪功率为1.4mW/平方厘米，照射强度为250MJ/平方厘米。紫外线B光照射后次日开始连续7天，每天使用10g/L荧光素钠染色后在裂隙灯显微镜下观察角膜情况，并用蘸有DMEM的棉拭子擦拭右眼角膜后进行HEK293T细胞培养，观察细胞病理学改变，以确定是否成功建立HSK复发期模型。

　　【模型特点】病毒接种后，角膜出现点状、树枝状或地图状病灶，而且角膜擦拭液HEK293T细胞出现细胞病理学改变，即表现为HEK293T细胞变大、变圆、呈葡萄状聚集改变，并使原本贴壁生长的细胞部分脱离漂浮在DMEM中，则判定为HSK原发感染。如果急性上皮性角膜炎消失，而角膜和三叉神经节PCR检测病毒阳性，则确定为HSK潜伏感染模型建立。如在紫外线B光照射后角膜再次出现点状、树枝状或地图状角膜病变，且角膜擦拭液培养出现CPE者即确定为HSK复发期模型建立。

　　【模型评估和应用】本方法简单，成模率高，可建立不同感染时期的HSK实验动物模型。家兔和小鼠均可用于这一模型的建立，但有研究发现，家兔虽然容易建立起潜伏感染模型，但却容易产生自发性复发。而用小鼠建立的HSK潜伏感染模型，却不容易产生自发性复发。302nm的紫外线照射诱发潜伏感染期小鼠模型复发不仅简便有效、容易损伤，而且也更接近人类HSK复发的环境条件，对进一步深入研究环境因素对人类HSK复发的影响及其防治具有很好的启发作用。