动物造模,药效评价,慢性结肠炎 z-bio 2024-07-29 172

　　1.造模材料  动物：雌性BALB/c小鼠(H-2基因表型)，使用时年龄均为8～10周；试剂与抗体：仓鼠抗小鼠CD3单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,  FITC)标记的抗小鼠CD45RB单克隆抗体、藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的抗小鼠 CIM单克隆抗体、FITC标记的抗小鼠CD25单克隆抗体和FITC标记的抗小鼠CD69单克隆抗体，RPMI1640培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素、左旋谷氨酰胺和庆大霉素。

　　2.造模方法

　　(1)C1345RBhigh CD4+幼稚T细胞的分离：首先使用Dynal磁珠分离健康BALB/c小鼠脾脏内的CD4+T细胞，具体操作严格按照说明书进行。将FITC标记的CD45RB单抗和 PE标记CD4单抗与CD4+T细胞一起孵育，30min后，使用PBS洗涤2次，以去除未结合的抗体。然后使用流式细胞仪(FACS Vantage)分离、获得CD45 RBhigh CD4+幼稚T细胞，经分析其纯度≥98％。

　　(2)细胞体内移植：调整CD45RBhigh CD4+幼稚T细胞浓度，按5×100000个/只(200μl PBS液)，经腹腔或尾静脉注射到同基因型重度联合免疫缺陷病(severe combined immuno- deficiency disease, SCID)小鼠体内，继续饲养。

　　3.造模原理  CD45RBhigh CD4+幼稚T细胞可诱导SCID小鼠发生慢性结肠炎。

　　4.造模后的一般变化  模型组小鼠3～5(4.1±0.3)周出现体重下降，大便变软；6～8(7.4±0.6)周出现明显的慢性结肠炎症状，表现为体重明显下降、腹泻、黏液脓血便、脱肛、毛发直立并失去光泽等。

　　5.造模后病理及生化变化  模型组小鼠结肠炎症性增粗，肠壁增厚。主要以升结肠和横结肠为主。显微镜下表现为整个结肠管壁浸润有大量的T淋巴细胞、单核巨噬细胞，还有少量的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞，尤其在黏膜层和黏膜下层最明显，并有炎性肉芽肿形成。肠上皮有溃疡形成，上皮细胞表面的黏液丢失，杯状细胞消失，腺窝脓肿。腺体增生、延长、绒毛表面结构变形和分叉样改变。另外，个别动物的盲肠、回肠末端和胃也出现明显的炎症改变。脾脏和肝脏均不同程度增大，镜下可见在肝脏的汇管区有明显的淋巴细胞浸润、部分肝细胞炎症性坏死，在汇管区偶尔可发现少量的分叶核巨细胞。肠系膜淋巴结重现，增大。

　　经流式细胞仪分析，发现炎症结肠黏膜固有层内的CD4+T细胞表面表达相当高的 CD69[(72.5±12.5)％]和CD25[(32.5±8.5)％]；肠黏膜组织内CD4+T细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌量较对照组增加，而IL-4和IL-5分泌量无变化。