动物实验 中国实验动物信息网 2020-08-25 1005

　　批准确定是否可以实现批准人员对幽门螺杆菌的全身免疫。在幽门螺杆菌感染的小鼠模型中评估了结合幽门螺杆菌抗原和氢氧化铝（AlOH3）的疫苗的功效。抗原和-AlOH3免疫力可诱导白介素5分泌，抗原特异性T细胞和免疫抗原。完全弗氏佐剂可诱导II型干扰素分泌和抗原特异性T细胞（由ELISPOT确定）。通过培养两个组织学胃活检标本来评估对两种免疫反应的保护，因为在遇到幽门螺杆菌后没有确认细菌。保护机制独立于抗体，使用来自抗体缺陷型MMT小鼠（免疫球蛋白敲除小鼠）和免疫小鼠的CD4 +脾T细胞足以将保护性免疫转移至免疫缺陷受体。结果表明，幽门螺杆菌疫苗的快速开发有其他或潜在的策略。 世界上*常见的病原体幽门螺杆菌是一种细胞外细菌，可感染胃粘膜并引起胃炎和消化性溃疡。通常认为感染主要在幼儿中发现。

　　因此，预防性疫苗的使用可能会阻止婴儿感染幽门螺杆菌，并防止成年人长期接受疫苗保护。疫苗接种策略主要是通过口腔和鼻腔通道诱导粘膜免疫。这些疫苗需要细菌外毒素佐剂，这些佐剂对于人类使用是不安全的。*近已经报道全身免疫是诱导和保护小鼠幽门螺杆菌免疫的可能手段。作者提出了这样的想法，即诱导免疫力需要Th1型免疫反应，幽门螺杆菌相关反应相关的胃癌病理学的贡献。该建议基于免疫球蛋白（IgG）类分析，并不直接测量细胞因子。几份报告证实，这种保护作用可能是由2型免疫介导的。我们将使用肠胃外免疫佐剂研究使用ELISPOT方法的这种更直接的方法，该方法会产生高度极化的Th1或Th2反应。在这项研究中，我们调查了在没有抗体的情况下用氢氧化铝佐剂（AlOH3）进行的全身免疫是否可以诱导保护性Th2CD4 T细胞免疫。 AlOH3诱导免疫力为幽门螺杆菌疫苗的开发带来了巨大的优势。这是因为AlOH3被批准用于人类。它的安全性，稳定性和低成本促进了人类幽门螺杆菌的大规模开发和应用。材料和方法：小鼠购自杰克逊实验室，并保持在某些无病原体的条件下。所用的小鼠是缺乏成熟的T和B淋巴细胞的C57BL/6或C57BL/6J-Rag1tm1Mom（rag1 /），或缺乏成熟的B细胞的C57BL/6-Igh-6tm1Cgn（mMT）。

　　细菌H.felis是在我们实验室的猫胃活检标本中分离出来的。从人胃活检标本中分离出幽门螺杆菌HPM6菌株，并在我们的实验室中通过小鼠长期传代对其进行了调整。通过PCR检测cagA证实了HpM6、用HpM6接种C57BL/6小鼠会引起慢性感染，这种感染在100％感染的小鼠中持续12个月。通过菌落形态，细胞形态，革兰氏染色，脲酶，过氧化氢酶，氧化酶等鉴定了两种幽门螺杆菌。细菌在固体培养基（琼脂血）上生长，并悬浮在布氏肉汤培养基中。小鼠免疫力和途径：幽门螺杆菌裂解物，我们和其他人已证明这是口服途径有效的实验疫苗抗原。卵清蛋白（OVA）购自Sigma Chemical Co.，Ltd.，而AlOH3购自Pierce。弗氏完全佐剂（CFA）是通过将结核分枝杆菌H37RA（Difco实验室）与1 mg/mL混合制成弗氏不完全佐剂而制成的。抗原和佐剂在水中按1：1比例混合，并在第0天将100 mg抗原和100 ml注射乳剂腹膜内注射到每只小鼠中。在第28天，通过胃插管通过18号针头通过胃插管施用含有1×10 7 cfu细菌的0.5mL培养物。通过将光密度设置为450m，使用先前建立的生长曲线确定细菌数。作为一种分离株，H。felis很难生长和繁殖，因此使用幽门螺杆菌生长曲线根据标准摄取值确定，如其他地方所述。滴度疫苗滴度的测定：28天后，通过组织银染色用幽门螺杆菌感染小鼠。用二氧化碳使动物安乐死。从十二指肠到card门的细长组织被手术切除。用10％甲醛缓冲液固定组织后进行组织学检查。每个小鼠样品的几个部分用银染剂染色，以帮助通过细菌的位置和形态鉴定幽门螺杆菌和幽门螺杆菌。在组织中未发现幽门螺杆菌，证实小鼠受到银染的免疫保护。此外，从感染了幽门螺杆菌的小鼠中培养胃活检标本，以检查细菌的存在。从胃窦手术去除含有幽门螺杆菌的样品，并与200mL培养基混合。将匀浆物加到含有7％马血的100mL培养基中。经过96次有氧培养后，免疫的小鼠样品在不生长细菌的情况下进行免疫保护。如果存在细菌，则幽门螺杆菌菌落形态，革兰氏染色以及脲酶，过氧化氢酶和氧化酶的产生决定了细菌。 H.felis的文化无法操纵，因为这种文化不可靠。 H.felis切片生长，而不是独立生长。病理学评估：与其他文献一样，对小鼠胃大曲率纵切面的炎症强度进行了评估。该部分包括胃窦和眼底粘膜的整个长度。胃窦炎症等级为0到3、眼底炎症等级为1到10。每只小鼠的总分是线性范围（焦点，多焦点，斑点或弥漫性）深度（浅表和/或扩散到基底，粘膜下或粘膜下或肌肉层）和炎症。性浸润的特征。浸润细胞的类型由组织学变化定义。过继转移：用小鼠T细胞CD4亚组柱试剂盒纯化CD4 T细胞，并通过尾静脉法将1000万个细胞注入小鼠。该号码已经确定，并将用于自身免疫领域的研究。酶联免疫吸附测定法（ELISPOT）可从脾脏制备单细胞悬液。将1x106个细胞接种于每孔含或不含幽门螺杆菌抗原的无血清HL-1培养基中，该培养基每孔含1 mM谷氨酰胺。*终浓度为5 mg/ml。将这些培养物添加到分别与PBS孵育的酶联免疫斑点平板上，该PBS分别特异性捕获干扰素或白介素5、R46-A2（4 mg/mL）或TRFK5（5 mg/mL）。 ..在室温下，用含1％牛血清白蛋白的PBS封闭1小时，用PBS洗脱4次，然后开始细胞培养24小时。然后，通过洗脱方法除去细胞，加入作为IFN-g的1mg/mL XMG1.2-HRP和作为IL-5的4mg/mL TRFK4以监测抗体，并将板孵育。对于IL-5、添加抗IgG2a-HRP，并继续孵育2小时。板中的抗体可以通过添加3-氨基-9-乙基咔唑来确认。使用Series 1免疫斑点图像分析仪评估结果。统计分析：实验组之间的ELISPOT分析通过方差分析确定。通过Fisher精确检验评估免疫小鼠的感染或未感染。结果：幽门螺杆菌感染和免疫的小鼠模型使用从猫或H.felis分离的人类病原体。与幽门螺杆菌不同，H.felis使用C57BL/6小鼠在小鼠以及人类胃炎中诱发胃粘膜的炎症性病变。另外，根据小鼠胃的组织学切片，H.felis感染更为严重。与幽门螺杆菌不同，它主要位于眼底的交界处。它主要在胃窦和胃底生长和再生。用H. felis或幽门螺杆菌抗原和氢氧化铝AlOH3或弗氏完全佐剂CFA乳化剂免疫C57BL/6小鼠。我们*近的研究表明，这些佐剂可以引起2型和1型免疫反应。

　　14天后，通过测量酶联免疫斑点法（1型和2型细胞因子（分别为IFN-γ，IL-5））来测试这些小鼠的脾细胞的幽门螺杆菌抗原特异性免疫应答。 （ELISPOT）。用乳化抗原和氢氧化铝免疫的小鼠细胞可能产生缺乏IFN-r的IL-5、产生IL-5的细胞的数量高于抗原特异性IFN-r的数量，两者均通过幽门螺杆菌免疫接种幽门螺杆菌。用抗原和完整的弗氏佐剂组（即高IFN-r）免疫后，观察到相反的细胞因子数目。此外，用弗氏完全佐剂CFA免疫的小鼠血清具有较高的IgG2a抗体滴度。根据产生的相对细胞数量和这些抗体亚型的免疫应答分布，抗原乳化剂诱导了氢氧化铝诱导的2型免疫应答，即弗氏完全佐剂的1型免疫应答。接下来，我们测试了诱导2型或1型幽门螺杆菌免疫是否可以保护肠粘膜免受幽门螺杆菌感染。用幽门螺杆菌或H.felis用氢氧化铝或弗氏完全佐剂免疫C57BL/6小鼠。对照小鼠中注射的佐剂含有无关的对照蛋白卵清蛋白或未免疫。在28天和28天后，强制口服幽门螺杆菌1×107，并通过胃粘膜银染法目测评估细菌计数。通过细菌培养方法确定是否存在幽门螺杆菌。完全免疫小鼠的这项研究可以提供出色的保护作用，而不管佐剂如何。通过观察在银染组织中不存在幽门螺杆菌。但是，在14只对照小鼠中有12只感染了幽门螺杆菌。在八只小鼠中，有七只被注射了幽门螺杆菌。注射氢氧化铝后无感染。使用氢氧化铝佐剂和弗氏完全佐剂后的保护作用非常重要。小鼠H. felis比幽门螺杆菌感染更严重。 29只小鼠中有28只感染了强烈的细菌附着在胃部。每个胃平均有86个被感染的腺体。使用H.feli抗原氢氧化铝佐剂在小鼠中未发现细菌。弗氏完全佐剂和幽门螺杆菌乳化剂的使用也具有保护作用（21例中有5例被感染）。我们的研究和其他研究表明，霍乱毒素必须与佐剂一起使用才能有效地进行粘膜疫苗接种策略。氢氧化铝和弗氏完全佐剂与抗原一起使用也是基于有效的粘膜疫苗接种策略。乳化氢氧化铝和费氏佐剂后，在完全用弗氏佐剂免疫的小鼠中未发现细菌感染，相比之下，费氏佐剂乳化后很少见感染。 ..诱导1型或2型免疫是粘膜对幽门螺杆菌免疫的替代方法。小鼠切片的HE染色显示，用氢氧化铝或完全弗氏佐剂免疫后，在胃窦和底部粘膜有相同的粘膜炎症。炎症程度由于幽门螺杆菌抗原免疫引起的炎症特征和程度与先前研究的霍乱毒素佐剂免疫没有显着差异。用氢氧化铝，弗氏完全佐剂和幽门螺杆菌抗原免疫的小鼠的平均眼底炎症分别为7.2 + 0.9和7.4 + 0.7。用氢氧化铝，弗氏完全佐剂和幽门螺杆菌抗原免疫的小鼠的平均胃炎分别为2.0 + 0和2.1 + 0.6、在所有情况下，用幽门螺杆菌抗原免疫的小鼠比用卵白蛋白免疫的小鼠表现出更严重的炎症。在其他实验中也观察到了接种后的这种胃炎。它可能是由对幽门螺杆菌免疫记忆的继发性免疫引起的。

　　接下来，我们开始研究免疫后针对幽门螺杆菌的免疫系统。完全弗氏佐剂，例如霍乱毒素，具有剧毒，不应在人类中使用。我们专注于氢氧化铝佐剂的使用。在随后的实验中，使用了小鼠H.felis模型。与幽门螺杆菌相比，这种生物体在小鼠中表现出更明显的炎症，并引起了较重的感染，使其更易于在组织切片中观察到。用氢氧化铝AlOH3或卵清蛋白和H.felis抗原免疫同源uMT小鼠（免疫球蛋白敲除小鼠）。疫苗接种后是否可以提供保护性抗体。使用卵清蛋白对照组测试所有八只免疫球蛋白敲除小鼠uMT。胃内注射粪便后，它被细菌感染并显示出较高的细菌繁殖能力。

　　但是，只有一只带有氢氧化铝佐剂H.felis的免疫球蛋白敲除小鼠uMT表现出强大的免疫保护作用。在完全免疫的B6小鼠中，这些炎症反应没有显着差异。用氢氧化铝和H. felis免疫后，胃窦发炎为7.8 + 0.6、眼底发炎为2.38 + 0.5、卵清蛋白和氢氧化铝免疫后，窦腔和眼底的炎症分别为3.7 + 1.5和1.5 + 0.5、这与先前使用口服免疫球蛋白敲除小鼠uMT的结果一致。这些实验表明，接种疫苗后无需进行抗体免疫。接下来，进行实验以检查是否可以保护来自接种小鼠的纯化的T细胞免于过继转移。免疫后28天，用H.felis和氢氧化铝，卵清蛋白和氢氧化铝，H.felis和完全弗氏佐剂免疫的C57BL/6小鼠脾细胞中的柱纯化CD4 T细胞。讨论：简而言之，已证明使用氢氧化铝AlOH3作为全身免疫的佐剂可诱导针对介导CD42型细胞介导的免疫力的幽门螺杆菌和幽门螺杆菌的保护性小鼠。这些发现可能直接影响人类幽门螺杆菌疫苗的开发。批准的用于人体的佐剂可能是可行的替代实验，可通过口服给药诱导幽门螺杆菌的粘膜免疫。为了进一步证实这一点，旨在调查父母接种幽门螺杆菌疫苗对新生婴儿的影响的另一系列实验将使用正常且可复制的皮下免疫以获得保护性免疫。

　　Guyetal*近报道了这种观点，他引入了一种新的幽门螺杆菌疫苗接种方法，这种疫苗违反了长期粘膜免疫的原理。第二、与圭耶塔的发现相反，幽门螺杆菌需要1型免疫应答。我们的数据表明2型与1型免疫反应同样重要，并且可能更有效地对抗幽门螺杆菌感染。氢氧化铝是人类中唯一可用的佐剂，并且是触发2型免疫反应的佐剂。*近的一些报告建议：幽门螺杆菌2型肝炎免疫接种（口服霍乱毒素和其他引起2型或2型和1型混合反应的实验性免疫佐剂） （包含）。