动物造模,抗原诱导EAE模型 z-bio 2023-11-21 667

　　(1)用豚鼠脊髓匀浆免疫Wistar大鼠诱导EAE模型

　　①实验动物和试剂：实验动物。雌性Wistar大鼠，6～8周龄，体重为130～200g；豚鼠，雌性，体重为330～400g。试剂。卡介苗冻干粉、百日咳疫苗、完全弗氏佐剂。完全弗氏佐剂(complete freund adjuvant，CFA)临用前在CFA加入结核杆菌冻干粉，使其终浓度为4mg／L。

　　②豚鼠全脊髓匀浆-完全弗氏佐剂的配制：豚鼠以氯胺酮过量麻醉后，以预冷的0.9％氯化钠溶液心脏灌流至无血液流出后，取出豚鼠脊髓，去除脊膜后用预冷的生理盐水制成50％(m／V)的豚鼠脊髓生理盐水匀浆，再与等量的CFA混匀后制成油包水型乳剂，此即为免疫抗原。

　　③诱导方法：实验组于大鼠4足垫皮内各注射免疫抗原0.1ml，1只共计0.4ml，同时足跖背面皮内注射百日咳疫苗0.1ml。实验对照组大鼠于4足垫皮内各注射等量CFA加生理盐水。

　　(2)用豚鼠脊髓匀浆为抗原致敏DA大鼠诱导EAE动物模型：①实验动物。Dark Agouti(DA)大鼠，雌性8～10周，体重250～300g。②抗原佐剂乳化物的制备。以豚鼠脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH)与弗氏完全佐剂均匀混合作为抗原佐剂乳化物。豚鼠以戊巴比妥钠麻醉后(50mg／kg，腹腔注射)，以预冷的冰生理盐水心脏灌注至右心房流出液清亮时，小心取出豚鼠脊髓，挑去脊膜及血管，称质量，加等量的完全弗氏佐剂(CFA)，用注射器反复抽打，制成油包水状态，即成抗原佐剂乳化物。③DA大鼠EAE动物模型建立。DA大鼠尾根部皮肤常规消毒后，进行单点皮下注射抗原佐剂乳化物0.2ml。免疫当日及免疫后所有动物每日观察大鼠饮食、活动情况，并称量体重。

　　(3)用同源猴脑白质匀浆制作食蟹猴EAE模型：①实验动物。食蟹猴，雌性6～10月，体质量2.5～3.0kg。②抗原佐剂乳化物的制备。健康食蟹猴脑，新鲜无菌保存于一70℃，在18℃下去灰质，按体质量／体积＝1／1.5将猴脑白质加PBS，制成猴脑白质匀浆，按体积／体积＝1／1加CFA，用注射器反复抽打，制成油包水状态，即成抗原佐剂乳化物。③食蟹猴EAE动物模型的建立。致敏实验动物产生EAE的途径有皮下、皮内、肌内、腹腔和静脉注射多种途径，经大量动物实验研究证实皮下多部位注射致敏原诱导EAE的发生率*高。我们采取腋窝和腹股沟皮下注射免疫动物，每处注射0.2ml，每次3～4处。5～7d后重复注射1次。④猴EAE的临床病情分级标准。分为6级，0级，正常；1级，嗜睡、厌食及体质量下降；2级，共济失调、震颤；3级，视力下降、偏瘫及截瘫；4级，四肢瘫；5级，濒死状态。a．EAE的病理检查。对发病后10d的EAE猴进行尸解，取猴脑和脊髓和视神经，用40ml／L的甲醛溶液固定6h，流水冲洗后，从矢状窦将脑切成两半，然后按冠状面分别将额、颞、顶、枕、小脑、脑干、脊髓切成0.5cm厚的组织块，按常规方法脱水、透明、浸润、包埋、制成蜡块。b．染色方法。用HE常规染色观察炎症变化，用Luxol fast blue染色法来观察髓鞘变化。c．电镜切片制作与观察。迅速将新鲜切取的视神经修整成1mm×1mm×1mm 大小的组织块置于25g／L的戊二醛和20g／L多聚甲醛前固定液中作固定3h以上，取出后，以四氧化锇后固定1.5h，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon 812包埋，AO型超薄切片机切片，醋酸铀及柠檬酸铅双染，*后用日立H-600透射电镜观察。