【动物实验】-Raf-1基因重组腺病毒siRNA载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响

动物实验,Raf-1基因

中国实验动物信息网

2020-08-24

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　　目的：构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体，并将其转导至大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。
　　方法：合成大鼠Raf-1的靶序列和阴性对照序列，并将退火后的DNA定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中，得到pAdTrack-siRaf-1质粒。将PmeI线性化后，它与BJ5183细菌结合。将pAdEasy-1骨架质粒同源重组后，得到pAd-siRaf-1质粒，将其转染到HEK293细胞中，包装后得到pAd-siRaf-1腺病毒颗粒，然后再培养到原代培养的心肌细胞中。我被感染了。蛋白质印迹用于检测针对Raf的siRNA。 -1、使用液体闪烁计数器测量NF-κB基因的抑制效率，3H-亮氨酸（[3H] -leu）摄取率，并使用HJ2000图像分析系统测量细胞表面积。
　　结果：重组腺病毒载体经酶切和鉴定，制备的病毒感染效率高。携带Raf-1的病毒颗粒能够有效抑制心肌细胞中的AngII，细胞表面积和[3H诱导的Raf-1表达。 ] -leu增加并下调Raf-1和NF-κB表达。
结论：pAd-siRaf-1重组腺病毒载体已成功构建并包装入HEK293细胞的重组腺病毒中。转染心肌细胞后，可以有效抑制Raf-1和NF-κB的表达，并抑制AngⅡ诱导的心肌。