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【动物实验】-Raf-1基因重组腺病毒siRNA载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响
动物实验,Raf-1基因
中国实验动物信息网
2020-08-24
835
目的:构建特异性抑制大鼠
Raf-1基因
的重组腺病毒载体,并将其转导至大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。
方法:合成大鼠Raf-1的靶序列和阴性对照序列,并将退火后的DNA定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中,得到pAdTrack-siRaf-1质粒。将PmeI线性化后,它与BJ5183细菌结合。将pAdEasy-1骨架质粒同源重组后,得到pAd-siRaf-1质粒,将其转染到HEK293细胞中,包装后得到pAd-siRaf-1腺病毒颗粒,然后再培养到原代培养的心肌细胞中。我被感染了。蛋白质印迹用于检测针对Raf的siRNA。 -1、使用液体闪烁计数器测量NF-κB基因的抑制效率,3H-亮氨酸([3H] -leu)摄取率,并使用HJ2000图像分析系统测量细胞表面积。
结果:重组腺病毒载体经酶切和鉴定,制备的病毒感染效率高。携带Raf-1的病毒颗粒能够有效抑制心肌细胞中的AngII,细胞表面积和[3H诱导的Raf-1表达。 ] -leu增加并下调Raf-1和NF-κB表达。
结论:pAd-siRaf-1重组腺病毒载体已成功构建并包装入HEK293细胞的重组腺病毒中。转染心肌细胞后,可以有效抑制Raf-1和NF-κB的表达,并抑制AngⅡ诱导的心肌。
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