国自然热点：超详细！一文带你轻松读懂DNA甲基化【实用干货】

国自然,DNA甲基化

中国实验动物信息网

2023-04-11

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*近几年关于DNA甲基化的论文发表数量巨大，2022年发文量就有7000多篇。

　　DNA甲基化的概念

　　DNA甲基化（DNA Methylation)：是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基化转移酶（DNMT）的作用下，通过共价键结合的形式获得一个甲基基团的过程。DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变DNA片段的活性、从而改变遗传表现，是一种非常保守的表观遗传修饰。它在调控基因表达、胚胎发育、细胞增殖、细胞分化、维持基因组稳定和抵御外源DNA病毒入侵等生物学过程起到了至关重要的作用。DNA甲基化可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位等，它们分别由不同的DNA甲基化酶催化，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。5-mC广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中，是目前研究*多的一种DNA甲基化修饰形式。

　　DNA甲基化的机制

　　DNA甲基化时，胞嘧啶从DNA双螺旋上突出，进入能与酶结合的裂隙中，在胞嘧啶甲基转移酶（Dnmts）催化下，把活性的甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至胞嘧啶5位上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。DNA的甲基化模式是通过DNA甲基转移酶实现的。（1）DNA甲基化酶分为2类：维持DNA甲基化转移酶（Dnmt1）和从头甲基化酶（Dnmt3a、Dnmt3b和 Dnmt3L 等）。

　　（2）DNA甲基化反应分为2种类型。一种是2条链均未甲基化的DNA被甲基化，称为从头甲基化。从头甲基化是指对非甲基化的DNA进行甲基化修饰，主要发生在胚胎发育的早期，用于胚胎早期细胞设定甲基化状态。

　　另一种是双链DNA的其一条链已存在甲基化，另一条未甲基化的链被甲基化，这种类型称为保留甲基化。

　　DNA甲基化和去甲基化的作用

　　DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化如何促进表达的抑制仍然不清楚，并且已经提出了各种假设。

　　1、对于某些转录因子，例如AP-2，c-myc，CREB / ATF，E2F和NF-kB，DNA甲基化被认为会产生物理屏障，消除对启动子结合位点的获取。

　　2、DNA甲基化之后，甲基-CpG结合域蛋白（MBD）缔合，而甲基-CpG结合域蛋白（MBD）又会招募组蛋白去乙酰化酶（HDAC）等复合物（如Sin3、NurD、NCoR）。结果，染色质被压实，基因表达受到抑制。

　　5-mC并不是一个一直持续稳定的DNA修饰，也会发生去甲基化过程。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA的去甲基化由基因内部的片段及与其结合的因子所调控。有两种假说可以解释DNA去甲基化的分子机制。一种假说与DNA半保留复制联系在一起，为被动去甲基化。如果甲基化的DNA经半保留复制后不被甲基化，其DNA则处于半甲基化状态，半甲基化的DNA如再次发生DNA半保留复制，而DNA甲基化活性仍被抑制，则有50%细胞处于半甲基化状态。第二种假说，DNA去甲基化由DNA去甲基化酶催化。在DNA糖苷酶的作用下脱掉甲基化碱基的反应，等同于被损伤的DNA在糖苷酶及无碱基核酸酶酶切偶联催化下的修复反应。

　　DNA去甲基化的起始机制依旧是个谜。

　　DNA甲基化的生物学作用

　　DNA甲基化在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、及肿瘤和疾病的发生、发展紧密相关，具有至关重要的作用。（1）DNA甲基化与肿瘤发生癌症是从一个单细胞开始的，这个细胞经历了许多变化，使得其表型与它正常的前体不同。尽管这个过程可以由控制细胞生长的关键基因所驱动，但许多表达的变化可能是由于表观遗传改变（主要是DNA甲基化）。肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体甲基化水平的降低与局部甲基化水平的升高。● 癌症细胞的某些基因由于调节区域中CpG岛的高甲基化而失活，而这些调节区域在正常组织中未甲基化。例如：视网膜母细胞瘤肿瘤基因1（RB1）。● 异常的CpG岛甲基化通过影响参与关键细胞过程的基因来促进癌症的发展和进展。例如：死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)。

　　● 此外，在肿瘤细胞中，癌基因处于低甲基化状态而被激活，抑癌基因处于高甲基化状态而被抑制。尽管DNA甲基化可能并不在所有癌症中起主导作用，但毫无疑问的是，这些修饰模式的变化*终会影响细胞的易感性和肿瘤表型。（2）DNA甲基化与胚胎发育在胚胎发育的过程中，基因组范围内的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，其中，改变*为剧烈的是配子形成期与早期胚胎发育阶段。错误甲基化模式的建立可能会引起人类疾病，如脆性X染色体综合征。（3）DNA甲基化与遗传物质的稳定性研究证明，细菌DNA复制起始与DNA甲基化及DNA与细菌质膜的相互作用有关，DNA甲基化作为一种标签决定了复制起始点，控制了复制起始，使得DNA复制与细胞分裂保持一致；DNA错配修复是细胞增殖过程中纠正DNA复制错误的重要手段。复制后双链DNA在短期内（数分钟）保持半甲基化状态，错配修复系统从而能够区分旧链与新链，为新链中掺入的错误碱基提供了分子标记。（4）DNA甲基化与基因表达调控DNA甲基化为非编码区（如内含子等）的长期沉默提供了一种有效的抑制机制。

　　DNA甲基化的应用

　　DNA甲基化在疾病发生发展、环境因素暴露与响应、发育和分化、疾病标志物研究中有着广泛的应用。临床上主要应用于肿瘤的诊断。（1）早期诊断和筛查：正常细胞发生癌变，变成肿瘤细胞。肿瘤细胞也会经历“生老病死”，肿瘤细胞中的物质可能释放到血液中，比如肿瘤细胞的 DNA，它们随着血液循环而流动，这也就是我们所说的循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。不同类型的癌症的甲基化模式具有高度特异性，不同阶段的癌症的ctDNA水平也有差异，因此可以通过液体活检检测ctDNA的水平和甲基化特征来实现肿瘤的早期诊断以及分期。（2）预后风险预测ctDNA的甲基化特征可以预测癌症患者的术后复发及死亡风险，有助于调整治疗方案，评估是否需要术后化疗以及确定化疗方案。（3）治疗疗效评价液体活检采集ctDNA可以多次重复取样，非常有利于在病程中评估治疗疗效，实时监测患者的身体状况。

　　DNA甲基化的检测

　　DNA甲基化分析技术有多种方法，大致分为以下几种：（1）基于碱基分离的分析技术高效液相色谱法(HPLC)可将DNA水解成单个脱氧核糖核苷，分离并检测脱氧胞苷和5-甲基脱氧胞苷从而计算出基因组中5-mC含量。1980年，Kuo等首次利用高效液相色谐紫外检测法分析基因组中5-mC的含量。随着质谱(MS)技术的发展，应用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)和超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)使得5mC检测的选择性和灵敏度明显增强。由于具有高的准确度和灵敏度，HPLC-MS是检测全基因组5-mC含量的金标准方法。（2）基于甲基化敏感限制性内切酶处理的分析技术甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，利用消化处理可以特异性识别甲基化序列，这类酶一般只能识别一个甲基化碱基位点。甲基化敏感性内切酶消化后扩增方法操作简便、应用范围广，但只能定性或半定量的检测目的片段的某一位点甲基化状态，不能定量，若酶消化不完全则会影响结果。（3）基于亚硫酸氢盐处理的测序技术经典亚硫酸氢盐测序是目前研究DNA甲基化*重要的方法。亚硫酸氢盐测序(BS-seq)的原理是利用亚硫酸氢盐对非甲基胞嘧啶的高效脱氨作用，生成尿嘧啶，在随后的测序中被读成胸腺嘧啶，而5mC和5hmC均对亚硫酸氢盐不敏感，通过PCR产物直接测序可判断DNA的甲基化。该方法精确度高，可知目的片段每一个CG、CHG、CHH位点的甲基化状态，被认为是DNA甲基化检测的“金标准”。但缺点如下：①不能区分5mC和5hmC；②出现转化不完全的情况；③耗时长；④通过克隆拷贝数计算甲基化程度有一定误差。（4）基于亲和富集处理的测序技术该技术包括DNA甲基化免疫沉淀芯片检测或测序和甲基化DNA特异性结合蛋白富集测序。该方法经济有效，可用于大批量样品的甲基化检测。缺点是不能定量，分辨率低(通常是150 bp左右，无法达到单碱基分辨率)，难以获得低甲基化区域信息。（5）第三代测序技术第二代测序(NGS)因价格便宜、实验流程成熟可靠，已成为检测DNA甲基化水平的标准工具，但短读技术有其固有的局限性，如从头组装、单倍体定相和结构差异检测困难等。第三代测序技术主要包括单分子实时测序技术(SMRT)和单分子纳米孔测序技术。相对第二代测序技术，第三代测序技术的高错误率和高费用限制了其应用。

　　参考文献

　　【1】DOI: 10.1146/annurev-biochem-103019-102815

　　【2】DOI: 10.1038/npp.2012.112

　　【3】DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-15-3278

　　【4】DOI: 10.1016/j.ymeth.2020.10.002