动物造模,CRISPR/Cas9技术 中国实验动物信息网 2022-06-08 471

　　目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因，构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。

　　方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列，分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成， sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞，受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠，首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。

　　结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录，mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后，获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型，分别是10 bp和11 bp的缺失突变；而Rag2只有一个基因型，为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比，小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后，肿瘤生长良好，且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。

　　结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变，并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。